Μελέτη και κλινική αξιολόγηση νέων βιοδεικτών στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του ορθού

Abstract

Colorectal cancer (CRC) stands as the second leading cause of cancer-related deaths on a worldwide scale. According to global cancer statistics provided by the Global Cancer Observatory (GCO), the incidence of CRC and CRC-associated mortality are expected to surge by 30% by the year 2030. The transformation of benign colorectal incidentalomas into malignant neoplasms involves a complex, multistep process influenced by genomic instability, abnormal DNA methylation, and mutations in critical oncogenes and/or tumor-suppressor genes. Given the substantial heterogeneity in CRC, accurately assessing patient prognosis poses a challenging clinical endeavor. This incidence further results in under- and/or overtreatment phenomena during the clinical management of the disease. The in-depth molecular profiling of CRC tumors will lead to the identification of novel CRC biomarkers that assist the development of personalized therapeutic strategies. In the context of this Ph.D. thesis, the study initially brought to light the extensive and intricate range of mRNAs produced by the three most significant RAS genes, namely KRAS, NRAS, and HRAS. This involved a comprehensive analysis of splicing events and exon/intron boundaries. RAS proteins encode small GTPases that play a crucial role in signal transduction pathways. The hyperactivation of RAS signaling is a pivotal factor in the development of human malignancies. In approximately 50% of colorectal cancer (CRC) tumors, the KRAS gene is mutated, while mutations in NRAS and HRAS are also found but at a lower frequency. Notably, RAS mutations serve as an adverse predictive biomarker for the response to anti-EGFR targeted therapy. The application of a versatile, targeted nanopore-sequencing approach led to the discovery of 39 novel RAS mRNA transcript variants and provided insights into their expression patterns across a wide range of human cell lines. While this work has uncovered previously unknown facets of the RAS gene family, further research is necessary to fully understand the biological functions of these new alternative transcript variants and their potential protein isoforms. Subsequently, we delved into the examination and identification of differentially expressed tRNA-derived RNA fragments (tRFs) and miRNAs in non-malignant colorectal tissues and colorectal cancer (CRC) samples. These molecules were further assessed for their potential diagnostic and/or prognostic utility in CRC. These small non-coding RNA (sncRNAs) molecules play a role in regulating gene expression at the post-transcriptional level and are thus involved in carcinogenesis either as oncogenes or tumor suppressors. To discern the variations in miRNA and tRF expression between CRC samples and non-malignant tissues, we employed state-of-the-art next-generation sequencing techniques (NGS). Some of these sncRNAs were subsequently subjected to clinical evaluation within a substantial cohort of CRC tumors. MicroRNA-28-5p (miR-28-5p) targets several cancer-related genes and is hence involved in cell proliferation, migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition. In this study, we investigated the potential diagnostic and prognostic significance of miR-28-5p expression in colorectal adenocarcinoma, the most frequent type of colorectal cancer (CRC). Comparison of miR-28-5p levels among 86 pairs of colorectal tumors and their adjacent non-cancerous mucosae uncovered the downregulation of miR-28-5p expression in most malignant colorectal tumors (p=0,005). More importantly, high miR-28-5p expression predicts poor disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of colorectal adenocarcinoma patients. Multivariate Cox regression analysis revealed that miR-28-5p overexpression is a significant predictor of poor prognosis in colorectal adenocarcinoma, independent of tumor size, histological grade, TNM staging, radiotherapy and chemotherapy. interestingly, strong miR-28-5p expression retains its predictive potential regarding relapse among patients with negative regional lymph nodes and predicts poor OS in patients diagnosed with non-metastatic colorectal adenocarcinoma. Furthermore, the same cohort of patients was used to assess the potential diagnostic and prognostic utility of miR-15a-5p expression in colorectal adenocarcinoma. miR-15a-5p was significantly upregulated in colorectal tumors compared to non-cancerous colorectal mucosae, while ROC analysis suggested its potential use for diagnostic purposes. Moreover, miR-15a-5p overexpression predicts poor disease-free survival (DFS) and overall survival (OS). Multivariate Cox regression analysis confirmed that miR-15a-5p overexpression is a significant unfavorable prognosticator of DFS in colorectal adenocarcinoma, independent of other established prognostic factors plus treatment of patients. Importantly, miR-15a-5p overexpression retains its unfavorable prognostic value in patients with T3 colorectal adenocarcinoma and in those without distant metastasis (M0). More importantly, the cumulative DFS probability of patients with early-stage disease was significantly lower for those with colorectal adenocarcinoma overexpressing miR-15a-5p. Finally, the prognostic utility of 5'-tiRNA-ProTGG levels in CRC was investigated. For this purpose, total RNA was extracted from 155 malignant colorectal tumors and 74 adjacent noncancerous tissue specimens, polyadenylated and reverse-transcribed using an oligo-dT adapter as primer. Real-time quantitative PCR (qPCR) was used to assess the levels of 5'-tiRNA-ProTGG. Kaplan-Meier survival analysis demonstrated that high 5'-tiRNA-ProTGG levels predict both poor disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) of CRC patients. Of note, high 5'-tiRNAProTGG levels retain their unfavorable prognostic value in patients with rectal cancer and/or moderately differentiated CRC (grade II). More importantly, multivariate cox regression analysis highlighted that the overexpression of 5'-tiRNA-ProTGG constitutes an adverse prognostic factor predicting short-term relapse of CRC patients independently of the established prognosticators in CRC. Bioinformatics analysis unveiled a potentially critical role of 5'-tiRNA-ProTGG regarding the maintenance of cellular homeostasis, signaling, cell communication, and cellular motility.

O καρκίνος του παχέος εντέρου και του ορθού (ΚΠΕ-Ο) αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτων σχετιζόμενων με καρκίνο παγκοσμίως. Μέχρι το έτος 2030 οι νέες διαγνώσεις όσο και οι θάνατοι αναμένεται να αυξηθούν έως και 30% σύμφωνα με το παρατηρητήριο του παγκόσμιου οργανισμού υγείας (ΠΟΥ). Η ανάπτυξη καρκινικών όγκων στο παχύ έντερο αποτελεί μία πολυσταδιακή διαδικασία συσσώρευσης γενετικών ή/και επιγενετικών τροποποιήσεων οι οποίες προωθούν ενδιάμεσες καλοήθεις νεοπλασίες με τη μορφή αδενωμάτων και αδενωματωδών πολυπόδων, επί των οποίων αναπτύσσεται η πλειοψηφία των κακοήθων όγκων στο παχύ έντερο. Ο ΚΠΕ-Ο χαρακτηρίζεται από έντονη ετερογένεια με αποτέλεσμα να αποτελεί σημαντική κλινική πρόκληση η εκτίμηση της επιβίωσης αλλά και ο κίνδυνος υποτροπής των ασθενών. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε αύξηση των φαινομένων υπό- και υπερθεραπείας (undertreatment, overtreatment). Συνεπώς η μελέτη του μοριακού προτύπου των όγκων παχέος εντέρου αποτελεί επιτακτική ανάγκη στην διαδικασία ταυτοποίησης νέων βιοδεικτών καρκίνου για τη συγκεκριμένη νόσο, οι οποίοι θα συμβάλουν στην εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών. Αρχικά, στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε το μεταγραφωμικό πρότυπο καθιερωμένων βιοδεικτών καρκίνου και πιο συγκεκριμένα των βασικών πρώτο-ογκογονιδίων της οικογένειας RAS (KRAS, NRAS, HRAS) σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, αξιοποιώντας τη μεθοδολογία αλληλούχησης 3ης γενιάς και συγκεκριμένα τη μέθοδο αλληλούχησης μέσω νανοπόρου. Τα συγκεκριμένα γονίδια κωδικοποιούν τις αντίστοιχες RAS πρωτεΐνες οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια των μικρών G πρωτεϊνών και συμμετέχουν σε πολλαπλά ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Στις ανθρώπινες κακοήθειες εντοπίζονται διαρκώς ενεργοποιημένες κυρίως εξαιτίας σημειακών μεταλλαγών ή/και φαινομένων γονιδιακής ενίσχυσης. Σε ποσοστό περίπου 50% των ΚΠΕ-Ο εντοπίζεται μεταλλαγμένo το γονίδιο KRAS και σε μικρότερο ποσοστό τα NRAS και HRAS. Εκτός από τον καθοριστικό τους ρόλο στην ανάπτυξη του ΚΠΕ-Ο, η παρουσία μεταλλαγμένων RAS πρωτεϊνών αποτελεί ένα δυσμενή προβλεπτικό δείκτη για ανταπόκριση σε θεραπευτικά σχήματα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR), όπως τα cetuximab και panitumumab. Για το λόγο αυτό ο εντοπισμός νέων εναλλακτικών mRNA μεταγράφων των RAS γονιδίων ενδέχεται να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων βιολογικών λειτουργιών των συγκεκριμένων μεταγράφων καθώς και νέων υποψήφιων πρωτεϊνικών ισομορφών, ορισμένες εκ των οποίων ενδέχεται να αποτελούν μοριακούς δείκτες για τον ΚΠΕ-Ο. Συνολικά ανακαλύφθηκαν 39 νέα εναλλακτικά RAS mRNA μετάγραφα ενώ εκτιμήθηκε το πρότυπο έκφρασης τους μεταξύ των διαφορετικών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών. Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης νέων μικρών μη-κωδικών RNA (sncRNA) και πιο συγκεκριμένα miRNA και θραυσμάτων RNA προερχόμενα από tRNA (tRNA-derived RNA fragments, tRFs) ως πιθανοί διαγνωστικοί ή/και προγνωστικοί μοριακοί δείκτες για το ΚΠΕ-Ο. Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο στη διεθνή βιβλιογραφία ότι αρκετές κατηγορίες sncRNA μορίων εμπλέκονται καθοριστικά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε μετά-μεταγραφικό επίπεδο με αποτέλεσμα να προωθούν την ανάπτυξη καρκινικών όγκων είτε να διαθέτουν ογκοκατασταλτικό ρόλο. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε το πρότυπο έκφρασης των miRNA και tRF χρησιμοποιώντας δεδομένα αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing, NGS) προερχόμενα από ιστολογικά δείγματα ασθενών με ΚΠΕ-Ο και φυσιολογικών μαρτύρων. Η σύγκριση των διαφορετικών προτύπων έκφρασης των miRNA και tRF μεταξύ των διαφορετικών καταστάσεων, ανέδειξε sncRNA μόρια με σημαντικά διαφοροποιημένα επίπεδα έκφρασης. Ακολούθησε ο ακριβής προσδιορισμός της έκφρασης και η εκτενής κλινική αξιολόγηση της διαγνωστικής ή/και προγνωστικής αξίας για ορισμένα sncRNA μόρια στο ΚΠΕ-Ο. Το miR-28-5p μπορεί να λειτουργεί είτε σαν ογκογόνο είτε σαν ογκοκατασταλτικό miRNA ενώ έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιθήλιο-μεσεγχυματική μετάπτωση και τελικά την μετάσταση. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του miR-28-5p σε συνολικά 182 ιστολογικά δείγματα ΚΠΕ-Ο καθώς και 86 παρακείμενα του όγκου, μη-καρκινικά ιστοτεμάχια ανέδειξε ότι το miR-28-5p εκφράζεται σε χαμηλότερα επίπεδα στους καρκινικούς όγκους (p=0,005). Ωστόσο, κατά την ανάλυση επιβίωσης προέκυψε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-28-5p σχετίζονται με μειωμένη ολική και ελευθέρας νόσου επιβίωση των ασθενών με KΠΕ-Ο (p=0,003 και στις δύο περιπτώσεις αντίστοιχα). Επιπλέον, η πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox ανέδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του miR-28-5p αποτελούν έναν σημαντικό δυσμενή προγνωστικό δείκτη της ολικής (p=0,016) και ελευθέρας νόσου επιβίωσης (p=0,002) στο ΚΠΕ-Ο, ανεξάρτητο από τους ήδη καθιερωμένους όπως το μέγεθος του όγκου, το στάδιο του όγκου κατά TNM, το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου και τη λήψη ράδιο- ή/και χημειοθεραπείας. Τέλος, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-28-5p, σχετίζονται με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου μεταξύ των ασθενών στους οποίους κατά τη διάγνωση δεν υπάρχει διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων (N0) (p=0,020), καθώς και με μειωμένη ολική επιβίωση των ασθενών με μη-μεταστατικό ΚΠΕ-Ο (p=0,011). Χρησιμοποιώντας την ίδια ομάδα ασθενών πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση της έκφρασης και αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής και προγνωστικής αξίας των επιπέδων σχετικής έκφρασης του miR-15a-5p στο ΚΠΕ-Ο. Το miR-15a-5p έχει διαπιστωθεί ότι προωθεί τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη χημειοανθεκτικότητα των κυττάρων παχέος εντέρου μέσω της ρύθμισης των μονοπατιών των σηματοδοτικών μονοπατιών STAT3/TWIST1 και PTEN/AKT. Κατά την ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του miR-15a-5p διαπιστώθηκε σημαντικά αυξημένη έκφραση σε καρκινικά ιστολογικά δείγματα σε σχέση με το παρακείμενο μη-καρκινικό ιστό (p=0,003). Επιπλέον, η ικανότητα τον επιπέδων έκφρασης miR-15a-5p διακρίνουν τους καρκινικούς όγκους αναδείχθηκε τόσο από την ανάλυση ROC (AUC = 0.61, 95% CI 0.54–0.68, p=0.003) όσο και από τη μονομεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης παλινδρόμησης (OR=1.50, 95% CI=1.14–1.97, p=0.004). Τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του miR-15a-5p αποτελούν δυσμενή προγνωστικό δείκτη τόσο για την επιβίωση ελευθέρας νόσου (p=0,001) καθώς και ολική επιβίωση (p=0,035) των ασθενών με ΚΠΕ-Ο. Τα μοντέλα πολυμεταβλητής ανάλυσης κατά Cox ανέδειξαν την ανεξάρτητη των ήδη καθιερωμένων προγνωστικών παραμέτρων, κλινική αξία του miR-15a-5p στην εκτίμηση του σχετικού κινδύνου υποτροπής των ασθενών με ΚΠΕ-Ο (HR=5.40, 95% CI=1.93–15.09, p=0.001). Τέλος, ο δυσμενής προγνωστικός χαρακτήρας της υψηλής έκφρασης του miR-15a-5p διατηρείται και στις ομάδες των μη μεταστατικών ασθενών (M0) κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης καθώς και των T3 ασθενών. Οι μη μεταστατικοί ασθενείς που εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα το miR-15a-5p εμφανίζουν μικρότερη ολική επιβίωση (OS) (p=0,022). Οι ασθενείς με τοπικά προχωρημένη νόσο που υπερεκφράζουν το miR-15a-5p παρουσιάζονται με μειωμένη ολική (OS) (p<0,001) αλλά και ελευθέρας νόσου επιβίωση (DFS) (p=0,003). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον αποτελεί η παρατήρηση ότι ασθενείς χαμηλού TNM σταδίου (ΤΝΜ I/II) οι οποίοι υπερεκφράζουν το miR-15a-5p παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένη ελευθέρας νόσου επιβίωση (DFS) (p=0,004). Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η διαφοροδιαγνωστική και προγνωστική αξία του θραύσματος tRNA 5′-tiRNA-ProTGG χρησιμοποιώντας 155 καρκινικά και 74 μη-καρκινικά ιστολογικά δείγματα παχέος εντέρου. Καθώς τα RNA θραύσματα προερχόμενα από tRNA (tRF) αποτελούν μία μεταβλητή ομάδα sncRNA μορίων, αναπτύχθηκαν εξειδικευμένα πρωτόκολλα ποσοτικού προσδιορισμού για την ανάλυση της έκφρασής τους. H ποσοτική ανάλυση της έκφρασης για το 5′-tiRNA-ProTGG ανέδειξε μειωμένη έκφρασή του στα καρκινικά ιστολογικά δείγματα σε σχέση με το παρακείμενο μη-καρκινικό ιστό (p<0,001). Επιπροσθέτως, διαπιστώθηκε μέσω ανάλυσης καμπυλών Kaplan-Meier ότι τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του 5′-tiRNA-ProTGG αποτελούν δυσμενή προγνωστικό δείκτη στο ΚΠΕ-Ο όσον αφορά τόσο την ελευθέρας νόσου (p=0,021) όσο και την ολική επιβίωση των ασθενών (p=0,036). Ο δυσμενής προγνωστικός χαρακτήρας των υψηλών επιπέδων έκφρασης 5′-tiRNA-ProTGG για την επιβίωση των ασθενών διατηρείται τόσο σε εκείνους που χαρακτηρίζονται από όγκους παχέος εντέρου μέτριας διαφοροποίησης (Grade II) καθώς και σε αυτούς των οποίων ο όγκος εντοπίζεται στο ορθό. Σύμφωνα με το μοντέλο της πολυμεταβλητής ανάλυσης κατά Cox, τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης 5′-tiRNA-ProTGG αποτελούν έναν ανεξάρτητο, δυσμενή προγνωστικό δείκτη πρόβλεψης της υποτροπής στο ΚΠΕ-Ο (HR=1.94, 95% CI=1.14–3.32, p=0.024). Τέλος, η λειτουργική ανάλυση του 5′-tiRNA-ProTGG μέσω υπολογιστικών εργαλείων ανέδειξε τη πιθανή εμπλοκή του συγκεκριμένου μορίου στη ρύθμιση σημαντικών σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη ΚΠΕ-Ο, όπως τα MAPK, MTOR και PD-1/PD-L1.