Effects of dimethoate, an organophosphate pesticide, on photosynthesis of selected phytoplankton species

Abstract

The effect of dimethoate on photosynthesis of the phytoplankton species C. reinhardtii, D. tertiolecta, Tetraselmis sp., P. tricornutum, T. pseudonana, Anabaena sp. and Porphyridium sp. was investigated. Dimethoate is an organophosphorus insecticide. It was used as technical grade or as active ingredient (37%) of the commercial formulation Perfekthion, which is used on the field. Dimethoate was compared with DCMU that is a PSII inhibitor and partially with DBMIB that is a cytochrome b6f inhibitor. Both are positive controls. Dimethoate was also compared with Perfekthion, which contains solvents like cyclohexanon, solvent naptha and acetic anhydride in order to examine if the solvents have an additional effect on the photosynthesis of the phytoplankton species. Besides the pesticide effect comparison per phytoplankton species, the phytoplankton species were compared to investigate the responses of the different species against the insecticides. Saturated concentrations of 3 µmol dimethoate/µg Chl a, 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a and 45 pmol DCMU/µg Chl a that exhibited a similar effect on the OJIP fluorescence of the phytoplankton species were used. The respective applied DBMIB concentration was 0,5 nmol/µg Chl a.Initial experiments with pea thylakoids that are easier to get isolated than phytoplankton thylakoids were performed to get an indication about the acting area of dimethoate in the photosynthesis mechanism. Perfekthion showed a stronger inhibition than dimethoate on net oxygen evolution rate of the pea plant and both insecticides did not show an effect on PSI or the ATP-synthase.This information was used to create the appropriate experiments for the selected phytoplankton species. Oxygen evolution measurements were made by Clark electrode, Chl a fluorescence measurements (OJIP and NPQ) by PAM instrument and xanthophyll pigment analysis by HPLC. To determine the acting area of dimethoate and Perfekthion in the phytoplankton cells the effect of specific saturated pesticide concentrations on net oxygen evolution rate, Chl a fluorescence and specific xanthophyll pigment conversion was compared.Net oxygen evolution rate inhibition of the seven phytoplankton species was increased with increasing insecticide concentration. 45 pmol DCMU/µg Chl a showed a similar effect on net oxygen evolution rate than 3 µmol dimethoate/µg Chl a, while the effect of 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a was two times stronger than dimethoate, a sign that the commercial formulation acted differently on photosynthesis of the algae than the technical grade. C. reinhardtii and probably Porphyridium sp. was less affected in the saturated dimethoate-treated samples compared to the other tested species. 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a showed a similar inhibition (90-100%) on net oxygen evolution rate of all tested phytoplankton species. High concentrations of dimethoate decreased the respiration of D. tertiolecta and Tetraselmis sp. and high concentrations of Perfekthion decreased the respiration of Tetraselmis sp..OJIP fluorescence measurements were performed to determine the effect area of dimethoate and Perfekthion on the electron transport chain (ETC). Both insecticides and DCMU inhibited PSII beyond QA and the effect was stronger with increasing pesticide concentration. 3 µmol dimethoate/µg Chl a pointed out a middle inhibition on PSII while 500 nmol Perfekthion/µg Chl a a high or even total inhibition. A total inhibition was occurred in C. reinhardtii, T. pseudonana, Anabaena sp. and Porphyridium sp.. The effect of DBMIB on OJIP fluorescence was compared with dimethoate/Perfekthion and concluded that the used insecticides did not inhibit PSI, at least at lower insecticide concentrations.The effect of the pesticides on the maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) was measured by PAM instrument to examine the working efficiency of PSII in presence of each pesticide. 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a (tested in the 3 Chlorophyceaen and the 2 Bacillariophyceaen species) significantly decreased Fv/Fm compared to the control, except the Fv/Fm of P. tricornutum, where higher insecticide concentrations were necessary. 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a caused the strongest Fv/Fm decrease in D. tertiolecta. The solvents of Perfekthion probably dissociated the light harvesting complex from PSII. It is hypothesised that the free moving antennas fluoresced stronger in the ground fluorescence, resulting in a lower Fv/Fm compared to the control. 3 µmol dimethoate/µg Chl a and 45 pmol DCMU/µg Chl a exhibited a similar effect on Fv/Fm than the control in the 3 tested Chlorophyceaen and the 2 Bacillariophyceaen species. More than 18 µmol dimethoate/µg Chl a were necessary to show a slight decrease of the maximum photochemical efficiency compared to the control. Non-photochemical quenching (NPQ) of the phytoplankton species was measured in the light (NPQL) and in the dark (relaxation phase) (NPQDR) after pesticide application by PAM instrument. NPQ is the thermal dissipation of the excessive light energy. NPQL decreased with increasing dimethoate concentration, another evidence that the ETC was blocked. The insecticide that inhibited the ETC decreased the proton gradient. As the proton gradient triggers directly or indirectly NPQL, a decreased proton gradient resulted in a decreased NPQL. NPQL increased over time after application of 0,5-1 µmol Perfekthion/µg Chl a compared to 250 nmol Perfekthion/µg Chl a in C. reinhardtii, another indication of a photoinhibibtion of the cells. The photosystems get destroyed as the electrons cannot continue to move on the ETC. A fluorescence decrease was the result, as less intact chlorophylls were available, leading to an NPQL increase. The high NPQDR value in the dark supported this indication. In D. tertiolecta NPQL decreased at the highest used Perfekthion concentrations. NPQL over time was similar in the 3000 nmol/µg Chl a dimethoate and 45 pmol DCMU/µg Chl a-treated samples of the 3 Chlorophyceaen and the 2 Bacillariophyceaen species (except D. tertiolecta) and the NPQL values were under the control values. The saturated concentration of Perfekthion induced higher NPQL values than the saturated concentrations of dimethoate and DCMU in C. reinhardtii, Tetraselmis sp. and P. tricornutum.0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a drastically increased NPQDR and decreased the diadinoxanthin (Dd) de-epoxidation compared to control in P. tricornutum indicating that a diatoxanthin dependent quenching (qZ) could existed, probably in combination with qI. NPQDR was the NPQ measured at the end of the recovery phase in order to observe the relaxation kinetics of the cells in the dark. 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a increased NPQDR at 80% compared to the control in C. reinhardtii indicating probably a photoinhibition. In the same species and in P. tricornutum 3 µmol dimethoate/µg Chl a did not cause a significant difference on NPQDR compared to the control. Although the effect of 3 µmol/µg Chl a dimethoate and 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a was similar on OJIP fluorescence of C. reinhardtii and P. tricornutum the saturated concentration of dimethoate did not cause a photoinhibition in these two species, that probably was not the case in presence of Perfekthion. The NPQDR values did not exceed the control values in the 3 tested Chlorophycease and the 2 Bacillariophyceaen species (except D. tertiolecta) after application of 3 µmol dimethoate/µg Chl a and 45 pmol DCMU/µg Chl a. In Tetraselmis sp. probably a state transition occurred when a part of the antennas moved back to PSII in the dark increasing the fluorescence in the recovery phase. To obtain another piece of evidence for the acting site of dimethoate/Perfekthion, xanthophyll pigment measurements by HPLC were performed. The de-epoxidation state of Ax/Vx and Dt/(Dd+Dt) in the 3 tested Chlorophyceaen and 2 Bacillariophyceaen species respectively was investigated under high light conditions. Middle till high dimethoate and DCMU concentrations decreased the de-epoxidation of Vx to Ax and Dd to Dt compared to the control, an indication that dimethoate acted similar to DCMU, inhibiting PSII. The PSII inhibition decreased the proton gradient that resulted in decreased xanthophyll conversion of Vx to Ax and Dd to Dt. 0,5 µmol Perfekthion/µg Chl a did not cause a significant effect on the de-epoxidation state of Dt/(Dd+Dt) in T. pseudonana compared to the control. The same Perfekthion concentration decreased Ax/Vx in the 3 Chloeophyceae species and Dt/(Dd+Dt) in P. tricornutum compared to the control and the inhibition was similar to the inhibition that 3 µmol dimethoate/µg Chl a exhibited in these phytoplankton species.

Στη διατριβή αυτή εξετάστηκε η επίδραση του dimethoate στη διεργασία της φωτοσύνθεσης των φυτοπλαγκτονικών ειδών C. reinhardtii, D. tertiolecta, Tetraselmis sp., P. tricornutum, T. pseudonana, Anabaena sp. και Porphyridium sp.. Το dimethoate είναι ένα οργανοφωσφορικό εντομοκτόνο. Χρησιμοποιήθηκε ως καθαρή ουσία (technical grade) ή ως δραστική ουσία (37%) του εμπορικού σκευάσματος Perfekthion. Το Perfekthion χρησιμοποιείται στις αγροκαλλιέργειες για την χημική καταπολέμηση των εντόμων όπως του δάκου. Το dimethoate συγκρίθηκε με το DCMU που είναι αναστολέας του φωτοσυστήματος δύο (PSII) και εν μέρει με το DBMIB που είναι αναστολέας του κυτοχρώματος b6f. Το Dimethoate συγκρίθηκε επίσης με το Perfekthion το οποίο περιέχει διαλύτες όπως το κυκλοεξάνιο, διαλυτή νάφθα και οξικό ανυδρίτη, προκειμένου να εξεταστεί εάν οι διαλύτες επηρεάζουν την φωτοσύνθεση των φυτοπλαγκτονικών ειδών. Εκτός από τη σύγκριση της επίδρασης των ζιζανιοκτόνων ανά φυτοπλαγκτονικού είδους, έγινε σύγκριση των επιλεγμένων φυτοπλαγκτονικών ειδών ως προς την απόκρισή τους στο dimethoate και στο Perfekthion. Χρησιμοποιήθηκαν κορεσμένες συγκεντρώσεις και συγκεκριμένα 3 µmol dimethoate/μg Chl a, 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a, οι οποίες έδειξαν παρόμοια επιρροή στον φθορισμό OJIP στα αναφερόμενα φυτοπλαγκτονικά είδη. Η αντίστοιχη εφαρμοζόμενη συγκέντρωση DBMIB ήταν 0,5 nmol/μg Chl a.Πραγματοποιήθηκαν εισαγωγικά πειράματα με θυλακοειδή του αρακά που απομονώνονται ευκολότερα από τα φυτοπλαγκτονικά θυλακοειδή, προκειμένου να αντληθούν πληροφορίες σχετικά με την περιοχή δράσης του dimethoate/Perfekthion στον μηχανισμό της φωτοσύνθεσης. Το Perfekthion έδειξε ισχυρότερη αναστολή της παραγωγή του οξυγόνου από το dimethoate στο φυτό του αρακά. Και τα δύο εντομοκτόνα δεν επηρέασαν το PSI ή την ATP-συνθάση, τουλάχιστον όταν χρησιμοποιήθηκαν χαμηλές εως μεσαίες συγκεντρώσεις.Αυτές οι πληροφορίες χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των κατάλληλων πειραμάτων για τα επιλεγμένα φυτοπλαγκτονικά είδη. Οι μετρήσεις της παραγωγής οξυγόνου έγιναν με την συσκευή Clark electrode, οι μετρήσεις φθορισμού χλωροφύλλης α (OJIP και NPQ) με συσκευή PAM και η ανάλυση των ξανθοφυλλών με αέρια χρωματογραφία. Για να προσδιοριστεί η περιοχή δράσης του dimethoate και του Perfekthion στα φυτοπλακτονικά είδη συγκρίθηκε η επίδραση κορεσμένων συγκεντρώσεων των ζιζανιοκτόνων στις παραπάνω μετρήσεις.Η αναστολή της παραγωγής του οξυγόνου των επτά φυτοπλαγκτονικών ειδών αυξήθηκε με αύξουσα συγκέντρωση του εντομοκτόνου. 45 pmol DCMU/μg Chl a είχαν παρόμοια επίδραση στον ρυθμό παραγωγής οξυγόνου σε σχέση με 3 µmol dimethoate/μg Chl a, ενώ 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a είχαν δύο φορές ισχυρότερη επιρροή από τo dimethoate. Αυτό δείχνει ότι το εμπορικό σκεύασμα ενεργούσε διαφορετικά στη φωτοσύνθεση του φυτοπλαγκτού από την καθαρή ουσία του dimethoate. Το είδος C. reinhardtii και πιθανόν το Porphyridium sp. επηρεάστηκαν λιγότερο από την κορεσμένη συγκέντρωση dimethoate σε σύγκριση με τα άλλα εξεταζόμενα είδη. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a έδειξαν παρόμοια αναστολή της παραγωγής οξυγόνου σε όλα τα φυτοπλαγκτονικά είδη (90-100%). Υψηλές συγκεντρώσεις dimethoate μείωσαν τον ρυθμό αναπνοής του D. tertiolecta και του Tetraselmis sp. και υψηλές συγκεντρώσεις Perfekthion μείωσαν τον ρυθμό αναπνοής του Tetraselmis sp..Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις φθορισμού OJIP για να προσδιοριστεί η περιοχή δράσης του dimethoate και του Perfekthion στην αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων. Και τα δύο εντομοκτόνα καθώς και το DCMU παρεμπόδισαν την μεταφορά των ηλεκτρονίων στο PSII μετά την πλαστοκινόνη QA και η παρεμπόδιση ήταν ισχυρότερη με αύξουσα συγκέντρωση των ζιζανιοκτόνων. 3 µmol dimethoate/μg Chl a προκάλεσαν μια μέτρια παρεμπόδιση στο PSII, ενώ 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a μια υψηλή έως ολική παρεμπόδιση της μεταφοράς των ηλεκτρονίων. Ολική παρεμπόδιση σημειώθηκε στα είδη C. reinhardtii, Τ. pseudonana, Anabaena sp. και Porphyridium sp.. Η επιρροή του DBMIB στον φθορισμό OJIP συγκρίθηκε με το dimethoate/Perfekthion καταλήγοντας στο συμπέρασμα ότι τα εντομοκτόνα δεν παρεμποδίζουν την λειτουργία του PSI, τουλάχιστον σε χαμηλές εως μέτριες συγκεντρώσεις.Η επίδραση των ζιζανιοκτόνων στη μέγιστη φωτοχημική απόδοση (Fv/Fm) μετρήθηκε με την συσκευή PAM για να εξεταστεί η αποτελεσματικότητα της λειτουργίας του PSII υπό την παρουσία του ζιζανιοκτόνου. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a μείωσαν σημαντικά το Fv/Fm σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου στα 3 εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και στα 2 Bacillariophyceae, εκτός από το Fv/Fm του P. tricornutum όπου υψηλότερες συγκεντρώσεις Perfekthion ήταν απαραίτητες. Η συγκεκριμένη συγκέντρωση Perfekthion προκάλεσε την ισχυρότερη μείωση του Fv/Fm στο είδος D. tertiolecta. Πιθανόν οι διαλύτες του Perfekthion να απομόνωσαν το σύμπλεγμα συγκομιδής φωτός (light harvesting complex) από το PSII. Οι ελεύθερα κινούμενες κεραίες ενδεχομένως να φθόριζαν πιο έντονα, με αποτέλεσμα την ελάττωση του Fv/Fm σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a παρουσίασαν παρόμοια επιρροή στο Fv/Fm σε σχέση με το δείγμα ελέγχου στα εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και Bacillariophyceae. Περισσότερα από 18 µmol dimethoate/μg Chl a ήταν απαραίτητα για να φανεί μια ελαφριά μείωση της μέγιστης φωτοχημικής απόδοσης σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου.Η μη φωτοχημική απόσβεση (non-photochemical quenching = NPQ) των φυτοπλαγκτονικών ειδών μετρήθηκε με την συσκευή PAM στο φως (NPQL) και στο σκοτάδι (NPQDR) (φάση χαλάρωσης) κατόπιν προσθήκης του εκάστοτε ζιζανιοκτόνου. Το NPQL αναφέρεται στην θερμική διασπορά της παραπανίσιας ενέργειας φωτός. Το NPQL μειώθηκε με αύξουσα συγκέντρωση του dimethoate, που αποτελεί άλλη μια ένδειξη ότι η αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων ήταν παρεμποδισμένη. Όταν η αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων παρεμποδίζεται, λιγότερα πρωτόνια φτάνουν στο εσωτερικό των θυλακοειδών των κυττάρων. Τα πρωτόνια ενεργοποιούν άμεσα ή έμμεσα το NPQL και η μείωση των πρωτονίων συνεπάγεται σε μείωση του NPQL. Το NPQL του είδους C. reinhardtii αυξήθηκε με αυξανόμενο χρόνο ύστερα από προσθήκη 0,5-1 µmol Perfekthion/μg Chl a σε σύγκριση με 250 nmol/μg Chl a. Οι υψηλές συγκεντρώσεις του εντομοκτόνου πιθανόν να προκάλεσαν φωτοαναστολή, παρεμποδίζοντας ολοκληρωτικά την μεταφορά των ηλεκτρονίων από το PSII προς το PSI. Τα ηλεκτρόνια πιθανόν να κατέστρεψαν τα φωτοσυστήματα, το επίπεδο του φθορισμού ελαττώθηκε λόγω της ελάττωσης των ακέραιων χλωροφυλλών, το οποίο οδήγησε στην αύξηση του NPQL. Η υψηλή τιμή NPQDR στο σκοτάδι είναι επίσης ένα πιθανό δείγμα φωτοαναστολής στο είδος C. reinhardtii. Στο είδος D. tertiolecta, το NPQL μειώθηκε στις υψηλότερες εξεταζόμενες συγκεντρώσεις Perfekthion. Η χρονική ανάπτυξη του NPQL ήταν παρόμοια στα δείγματα των 3 ειδών Chlorophyceae και των 2 ειδών Bacillariophyceae (με εξαίρεση το είδος D. tertiolecta) ύστερα από προσθήκη 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a και οι τιμές NPQL ήταν κάτω από τις τιμές των δειγμάτων ελέγχου. Η κορεσμένη συγκέντρωση Perfekthion προκάλεσε υψηλότερες τιμές NPQL από την κορεσμένη συγκέντρωση του dimethoate και του DCMU στα είδη C. reinhardtii, Tetraselmis sp. και P. tricornutum.0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a αύξησαν έντονα το NPQDR και μείωσαν την παραγωγή της διατοξανθίνης (Dt) σε σύγκριση με τον δείγμα ελέγχου στο είδος P. tricornutum, υποδεικνύοντας ότι πιθανόν να υπήρχε μια απόσβεση εξαρτώμενη από την διατοξανθίνη (diatoxanthin dependent quenching = qZ), ενδεχομένως σε συνδυασμό με φωτοαναστολή. Το NPQDR ήταν το NPQ που μετρήθηκε στο τέλος της φάσης ανάκτησης, στο σκοτάδι, προκειμένου να εξετασθεί η χαλάρωση των κυττάρων. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a αύξησαν το NPQDR στο 80% σε σχέση με το δείγμα ελέγχου στο είδος C. reinhardtii, πιθανόν υποδεικνύοντας μια φωτοαναστολή. Στο ίδιο είδος και στο είδος P. tricornutum 3 µmol dimethoate/μg Chl a δεν προκάλεσαν σημαντική διαφορά στο NPQDR σε σχέση με τον δείγμα ελέγχου. Αν και η επίδραση των 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a ήταν παρόμοια στον φθορισμό OJIP των C. reinhardtii και P. tricornutum, η κορεσμένη συγκέντρωση dimethoate δεν προκάλεσε φωτοαναστολή σε αυτά τα δύο είδη σε αντίθεση με την πιθανή φωτοαναστολή που προκάλεσε το Perfekthion. Οι τιμές NPQDR δεν υπερέβησαν τις τιμές δειγμάτων ελέγχου κατόπιν προσθήκης 3 µmol dimethoate/μg Chl a και 45 pmol DCMU/μg Chl a στα εξεταζόμενα είδη Chlorophyceae και τα Bacillariophyceae (με εξαίρεση το είδος D. tertiolecta). Στο είδος Tetraselmis sp. πιθανόν συνέβη το φαινόμενο state transition, όπου ένα μέρος των κεραιών επέστρεψε στο PSII στο σκοτάδι, αυξάνοντας τον φθορισμό κατά την φάση χαλάρωσης των κυττάρων.Για να προστεθούν επιπλέον στοιχεία για την περιοχή δράσης του dimethoate/Perfekthion στο εσωτερικό των κυττάρων πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις ξανθοφύλλης με την αέρια χρωματογραφία. Διερευνήθηκε η αναλογία Ax/Vx και Dt/(Dd+Dt) στα 3 είδη Chlorophyceae και 2 Bacillariophyceae αντίστοιχα, υπό συνθήκες υψηλού φωτισμού. Οι μεσαίες έως υψηλές συγκεντρώσεις dimethoate και DCMU που χρησιμοποιήθηκαν μείωσαν την μετατροπή του Vx σε Ax και του Dd σε Dt σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Αυτή είναι μια ένδειξη ότι το dimethoate δρα παρόμοια με το DCMU, αναστέλλοντας την λειτουργία του PSII. Η αναστολή του PSII μείωσε την συγκέντρωση πρωτονίων που είχε ως αποτέλεσμα την μειωμένη μετατροπή της ξανθοφύλλης Vx σε Ax και Dd σε Dt. 0,5 µmol Perfekthion/μg Chl a δεν προκάλεσαν σημαντική διαφορά στην αναλογία Dt/(Dd+Dt) στο φυτοπλαγκτονικό είδος T. pseudonana σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. Η ίδια συγκέντρωση του Perfekthion μείωσε την αναλογία Ax/Vx στα 3 είδη Chlorophyceae και την αναλογία Dt/(Dd+Dt) στο P. tricornutum σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου και η αναστολή ήταν παρόμοια με την αναστολή που παρουσίασαν 3 µmol dimethoate/μg Chl a σε αυτά τα φυτοπλαγκτονικά είδη.