Development of implant treatments with neuroprotective and neurogenic activities for central nervous system injuries

Abstract

Central Nervous System (CNS) injuries, such as spinal cord or optic nerve injuries (SCI, ONI), affect thousands of individuals worldwide. Still no cure can handle the complex multifactorial nature of CNS injury. Along this direction, the present thesis evaluates novel combinatorial treatments for CNS injuries that contain three components: 1) Porous collagen-based scaffolds (PCS), biomaterials that provide structural support, inflammation regulation, a substrate for cellular migration and axonal elongation as well as a delivery system of therapeutic molecules or cells, 2) Neural Stem Cells (NSC), multipotent cells that can replace neuronal cells lost during CNS injuries, 3) Microneurotrophins (MNT), small-molecule mimetics of endogenous neurotrophins, that have demonstrated significant therapeutic effects on various animal models of human neurological diseases, but have not been evaluated in rodent models of CNS injuries yet.The first part of this thesis focuses on evaluating the effects of BNN27, the seminal MNT, on the mouse optic nerve crush (ONC) model. Results provide the first evidence on the effects of BNN27 on animal models of ONI. In particular, BNN27 administration significantly increased RGC survival and decreased microglia-mediated inflammation at 2 weeks post injury (wpi). BNN27 was delivered via eye drops or via a PCS graft. Interestingly, this study presents the first administration of MNT via a biomaterial graft and it highlights a more consistent and efficient neuroprotective effect provided by a targeted delivery at the injury site. The second part of this thesis focuses on evaluating the effects of combinatorial treatments on the dorsal column crush mouse SCI model. The first SCI study evaluated mouse embryonic NSC-seeded PCS grafts in this SCI model. The second SCI study combined NSC-seeded PCS grafts with systemic administration of BNN27. This thesis highlights PCS grafts as a promising delivery method of NSCs in SCI lesions, contrary to the widely used method of delivering NSCs in suspension via injection. NSC-seeded PCS grafts decreased glial scar and enhanced crucial events following SCI, such as neuron density, synaptogenesis, axonal elongation and angiogenesis at 12 wpi. Notably, NSC-seeded PCS grafts also led to statistically significant locomotion recovery starting at 9-10 wpi. This thesis also demonstrates the first evidence on the effects of BNN27 on animal models of SCI. Systemic administration of BNN27 decreased astrogliosis and neuronal loss following SCI. In addition, when BNN27 administration was combined with the implantation of NSC-seeded PCS grafts, BNN27 significantly increased the density of implanted NSC-derived cells, possibly addressing a major challenge of emerging NSC-based cell therapies.In conclusion, this thesis presents novel combinatorial treatments that could cope with the complexity of CNS injuries and could hopefully be new tools in regenerative medicine leading to the design of more effective therapies with clinical application.

Τα τραύματα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), συμπεριλαμβανομένων των τραυμάτων στο οπτικό νεύρο και το νωτιαίο μυελό, πλήττουν χιλιάδες ασθενείς κάθε χρόνο. Παρά την πρόοδο στην κατανόηση των μηχανισμών απόκρισης του ΚΝΣ στο τραύμα, οι διαθέσιμες θεραπείες παραμένουν ελάχιστα αποτελεσματικές. Οι μακροχρόνιες δραματικές επιπτώσεις στους ασθενείς τραύματος ΚΝΣ, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών που θα μπορούν να επιδράσουν θετικά στην επούλωση των πληγών του ΚΝΣ. Λόγω της πολυπαραγοντικής φύσης της διαδικασίας επούλωσης στο ΚΝΣ, είναι πλέον αποδεκτό ότι απαιτούνται συνδυαστικές θεραπείες, οι οποίες θα μπορούν να επιδράσουν σε πολλαπλά σημεία της.H παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στην ανάπτυξη και πειραματική αξιολόγηση νέων θεραπειών για τραύματα του ΚΝΣ που συνδυάζουν τις συμπληρωματικές δράσεις τριών συστατικών: (1) Πορώδη ικριώματα κολλαγόνου (ΠΙΚ), (2) Νευρικά Βλαστικά Κύτταρα (ΝΒΚ) και (3) Μικρονευροτροφίνες (ΜΝΤ). Τα ΠΙΚ είναι βιοϋλικά με εκτενή χρήση στην κλινική πρακτική της αναγεννητικής ιατρικής, καθώς παρέχουν φυσική στήριξη, έλεγχο της φλεγμονής στην περιοχή του τραύματος και μέσο για επιμήκυνση των αξόνων, ενώ δρουν και ως φορείς για τη μεταφορά βλαστικών κυττάρων και θεραπευτικών μορίων στο σημείο του τραύματος. Τα ΝΒΚ είναι πολυδύναμα κύτταρα που μπορούν να διαφοροποιηθούν και να αναπληρώσουν νευρικά κύτταρα που χάθηκαν στο σημείο του τραύματος. Οι ΜΝΤ είναι μικρά μόρια με δράσεις που μιμούνται τις ενδογενείς νευροτροφίνες και έχουν δείξει σημαντικές νευροπροστατευτικές και νευρογεννητικές δράσεις σε διάφορα είδη νευρώνων και ζωικά μοντέλα νευροεκφυλιστικών ασθενειών, αλλά δεν έχουν δοκιμαστεί ακόμα σε τραύματα του ΚΝΣ. Το πρώτο μέρος της διατριβής αξιολογεί τα αποτελέσματα της τοπικής χορήγησης της BNN27, την καλύτερα μελετημένη ΜΝΤ in vitro και in vivo, σε ένα μοντέλο τραύματος οπτικού νεύρου ποντικού (optic nerve crush). Συγκεκριμένα, εστιάζει στις δράσεις της ΒΝΝ27 στην προστασία των γαγγλιακών νευρώνων του αμφιβληστροειδούς (ΓΝΑ) από απόπτωση και την βελτίωση της αναγέννησης των αξόνων τους στο σημείο του τραύματος. Η BNN27 χορηγήθηκε είτε μέσω σταγόνων στο μάτι είτε μέσω εμποτισμού σε ένα ΠΙΚ, το οποίο τοποθετήθηκε γύρω από το οπτικό νεύρο στο σημείο όπου είχε προηγουμένως προκληθεί τραυματισμός με σύνθλιψη του οπτικού νεύρου, με σκοπό την τοπική απελευθέρωση της ΜΝΤ στο σημείο του τραύματος. Η αξιολόγηση των δράσεων της ΒΝΝ27 πραγματοποιήθηκε 2 και 10 εβδομάδες μετά τον τραυματισμό χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (για δείκτες απόπτωσης, φλεγμονής και αξονικής επιμήκυνσης) και πειράματα συμπεριφοράς (Optomotor Response assay). Σε δεύτερο στάδιο, αξιολογήθηκαν περισσότερες ΜΝΤ ex vivo σε αμφιβληστροειδείς ποντικιών για την επίδρασή τους στην αναγέννηση των αξόνων των ΓΝΑ.Τα αποτελέσματα έδειξαν για πρώτη φορά την επίδραση της ΒΝΝ27 σε ζωικό μοντέλο οπτικού τραύματος, καθώς η χορήγηση της ΒΝΝ27 οδήγησε στην αύξηση της επιβίωσης των ΓΝΑ και τη μείωση της φλεγμονής 2 εβδομάδες μετά το τραύμα. Παρ’ όλ’ αυτά, η ΒΝΝ27 δεν ώθησε την αξονική επιμήκυνση, ενώ η νευροπροστατευτική της δράση δεν ήταν μακροχρόνια, καθώς δεν παρατηρήθηκε στις 10 εβδομάδες μετά το τραύμα. Αυτά τα αποτελέσματα οδηγούν στην ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών δράσης των ΜΝΤ, καθώς και τον πιθανό συνδυασμό της ΒΝΝ27 με άλλες ΜΝΤ ή άλλα θεραπευτικά μόρια. Σημαντικό σημείο του πρώτου μέρους της διατριβής αυτής είναι επίσης η χορήγηση της ΜΝΤ για πρώτη φορά μέσω ΠΙΚ, η οποία έδειξε μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα σε σύγκριση με τη χορήγηση μέσω σταγόνων, αναδεικνύοντας τη σημασία της στοχευμένης χορήγησης θεραπευτικών μορίων στο σημείο του τραύματος.Το δεύτερο μέρος της διατριβής αξιολογεί τα αποτελέσματα συνδυαστικών θεραπειών σε ένα μοντέλο τραύματος νωτιαίου μυελού ποντικού (dorsal column crush). Αρχικά, αξιολογεί τη χορήγηση εμφυτευμάτων ΠΙΚ με ΝΒΚ στο σημείο του τραύματος και στη συνέχεια, το συνδυασμό του εμφυτεύματος με την υποδόρια (pellet) χορήγηση της ΒΝΝ27. Πιο συγκεκριμένα, εστιάζει στην εκτίμηση της ικανότητας των θεραπειών αυτών να σώσουν τους νευρώνες του νωτιαίου μυελού από την απόπτωση ύστερα από το τραύμα. Παράλληλα, διερευνά την ικανότητα της ΒΝΝ27 να βελτιώσει την επιβίωση και διαφοροποίηση των ΝΒΚ του εμφυτεύματος, καθώς και την ενσωμάτωση τους με τον γειτονικό ιστό. Η αξιολόγηση των επιδράσεων των θεραπειών αυτών πραγματοποιήθηκε 12 εβδομάδες μετά τον τραυματισμό χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία (για δείκτες απόπτωσης, πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης, φλεγμονής, αξονικής επιμήκυνσης, συναπτογένεσης και αγγειογένεσης) και πειράματα συμπεριφοράς που ποσοτικοποιούν τη βάδιση του ζώου (Horizontal Ladder Walking assay).Τα αποτελέσματα ανέδειξαν τη σημασία των ΠΙΚ στη μεταφορά των ΝΒΚ στο σημείο του τραύματος σε αντίθεση με τη μέθοδο ενέσιμης εισαγωγής διαλύματος ΝΒΚ. Η χορήγηση εμφυτευμάτων ΠΙΚ με ΝΒΚ μείωσε την ουλή γύρω από το τραύμα και αύξησε την πυκνότητα των νευρώνων, τη συναπτογένεση, την αξονική επιμήκυνση και την αγγειογένεση 12 εβδομάδες μετά το τραύμα. Επιπλέον, βελτίωσε σημαντικά τη βάδιση των ζώων κατά την 9η-10η εβδομάδα. Το δεύτερο μέρος της διατριβής αυτής δείχνει επίσης για πρώτη φορά την επίδραση της ΒΝΝ27 σε ζωικό μοντέλο τραύματος στο νωτιαίο μυελό, καθώς η χορήγηση της ΒΝΝ27 οδήγησε στη μείωση της ουλής γύρω από το τραύμα και της απώλειας των νευρώνων. Επιπλέον, κατά την ταυτόχρονη χορήγηση της ΒΝΝ27 με τα εμφυτεύματα ΠΙΚ με ΝΒΚ, η ΒΝΝ27 αύξησε σημαντικά την πυκνότητα των κυττάρων που προέρχονταν από τα ΝΒΚ, πιθανώς αντιμετωπίζοντας έτσι ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα των ΝΒΚ θεραπειών.Συμπερασματικά, η διατριβή αυτή παρουσιάζει καινοτόμες συνδυαστικές θεραπείες που θα μπορούσαν να δώσουν την ευκαιρία για ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπειών για την αντιμετώπιση των τραυμάτων στο ΚΝΣ, επικεντρώνοντας στη μεγάλη σημασία της προκλινικής έρευνας και θέτοντας την ως βάση για περαιτέρω κλινική εξέλιξη.