Διερεύνηση νέων παραγόντων στην παθογένεση του ηπατοκαρκινώματος: ο ρόλος του ενζύμου σύζευξης ουβικουιτίνης Ε2T (ubiquitin conjugating enzyme E2T, UBE2T) και της Perilipin 1 (PLIN1)

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) represents the sixth most common cancer and the third leading cause of cancer deaths worldwide. The main risk factors for the initiation and progression of HCC are: hepatitis B and C virus, as well as chronic alcohol consumption. The underlying molecular mechanisms of hepatocarcinogenesis are not fully understood, due to the complexity of cancer. This dissertation demonstrated the role of two new genes, UBE2T and PLIN1, in HCC. UBE2T is a E2 enzyme with a significant role in cell proliferation and genome stability. In this dissertation, UBE2T was transiently overexpressed and silenced in human HCC cell lines, HepG2 and Huh7. UBE2T overexpression led to the activation of MAPK/ERK, AKT/mTOR, Wnt/β-catenin signaling pathways, induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) and augmentation of the oncogenic phenotype, while UBE2T silencing led to their reversion. The role of UBE2T as an oncogene was further validated by the induction of oncogenic phenotype after UBE2T overexpression in the human immortalized hepatocyte cell line IHH. In HepG2 and Huh7, UBE2T affected the plasma membrane protein complex of E-cadherin/β-catenin. Specifically, UBE2T overexpression resulted in the reduction of E-cadherin expression, while it induced the nuclear translocation of β-catenin, thus promoting EMT. UBE2T silencing led to increased expression of E-cadherin and β-catenin at the plasma membrane. The inhibition of MAPK/ERK, AKT/mTOR, Wnt/β-catenin signaling pathways in monoclonal UBE2T-overexpression stable cell lines showed that UBE2T-driven β-catenin nuclear translocation and subsequent EMT is MAPK-ERK dependent. PLIN1, which is a structural protein of lipid droplets, was studied in accordance with the liver-specific transcription factor HNF4α. Lipogenesis induction in HepG2 and Huh7 was achieved via oleic-acid/DMSO treatment during a period of 150 days. Increased expression of PLIN1, HNF4α and of lipogenesis-related transcription factors, PPARα and PPARγ, was demonstrated in oleic-acid/DMSO cells. Furthermore, PPARα and PPARγ antagonist treatment led to further increase of PLIN1 and HNF4α. The findings of this dissertation highlight the functional role of UBE2T and PLIN1 in hepatocarcinogenesis. UBE2T led to the nuclear translocation of β-catenin, which is an important transcription factor during hepatocarcinogenesis, while PLIN1 altered the expression levels of the liver-specific factor HNF4α. Extended molecular networks related to actions of UBE2T and PLIN1 need to be elucidated. The understanding of the complicated stages of hepatocarcinogenesis is crucial for identifying novel therapeutic strategies against HCC.

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗΚΚ) αποτελεί τον έκτο πιο συχνό τύπο νεοπλασίας και την τρίτη σε συχνότητα αιτία θανάτου από κακοήθειες. Ανάμεσα στους κύριους προδιαθεσικούς παράγοντες για την ανάπτυξη και την εξέλιξη του ΗΚΚ συγκαταλέγονται ο ιός της ηπατίτιδας Β και C, αλλά και ο χρόνιος αλκοολισμός. Οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ηπατοκαρκινογένεση δεν έχουν αποσαφηνιστεί πλήρως, γεγονός που καταδεικνύει την πολυπλοκότητα του καρκίνου. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η δράση δύο νέων μοριακών στόχων στο ΗΚΚ, του UBE2T και του PLIN1. Η UBE2T είναι ένα Ε2 ένζυμο, το οποίο κατέχει καίριο ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και στη γενωμική σταθεροποίηση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκαν πειράματα παροδικής υπερέκφρασης και καταστολής της UBE2T στις ανθρώπινες ηπατικές καρκινικές κυτταρικές σειρές HepG2 και Huh7. H υπερέκφραση της UBE2T οδήγησε στην ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών MAPK/ERK, AKT/mTOR και Wnt/β-κατενίνης, στην επαγωγή της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικής μετατροπής (ΕΜΤ) και στην αύξηση του ογκογονικού φαινοτύπου, ενώ αντίθετα αποτελέσματα έδωσε η καταστολή της UBE2T. Επιπλέον, επαγωγή του ογκογονικού φαινοτύπου παρατηρήθηκε έπειτα από την υπερέκφραση της UBE2T στην ανθρώπινη αθανατοποιημένη ηπατική κυτταρική σειρά ΙΗΗ, ενισχύοντας το ρόλο του UBE2T ως ογκογονιδίου. Στα HepG2 και Huh7, η UBE2T επηρέασε το πρωτεϊνικό σύμπλοκο της Ε-καδερίνης/β-κατενίνης, το οποίο εδράζεται στην πλασματική μεμβράνη. Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση της UBE2T επέφερε μείωση των επιπέδων έκφρασης της Ε-καδερίνης και μετατόπιση της β-κατενίνης στον πυρήνα, οδηγώντας στην ΕΜΤ. Το αποτέλεσμα της καταστολής της UBE2T ήταν η αυξημένη παρουσία της Ε-καδερίνης και β-κατενίνης στην πλασματική μεμβράνη. Η αναστολή των σηματοδοτικών μονοπατιών MAPK/ERK, AKT/mTOR και Wnt/β-κατενίνης σε σταθερές κυτταρικές σειρές υπερέκφρασης της UBE2T οδήγησε στο συμπέρασμα πως η UBE2T-επαγόμενη μετατόπιση της β-κατενίνης στον πυρήνα και η επακόλουθη ΕΜΤ εξαρτάται κατά κύριο λόγο από το μονοπάτι MAPK/ERK. H PLIN1, η οποία αποτελεί δομική πρωτεΐνη των λιποσταγονιδίων, μελετήθηκε αναφορικά με τον ηπατοειδικό παράγοντα HNF4α. H επαγωγή της λιπογένεσης στα HepG2 και Huh7 πραγματοποιήθηκε μέσω της επίδρασης με oleic-acid/DMSO, σε χρονικό διάστημα 150 ημερών. Παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης της PLIN1, του HNF4α, αλλά και των σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων της λιπογένεσης, PPARα και PPARγ στα oleic-acid/DMSO κύτταρα. Επιπλέον, δράση ανταγωνιστών των PPARα και PPARγ οδήγησαν σε περαιτέρω αύξηση της έκφρασης των PLIN1 και HNF4α. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναδεικνύουν το ρόλο, τόσο της UBE2T όσο και της PLIN1 στην ηπατοκαρκινογένεση. Η UBΕ2Τ οδήγησε στην πυρηνική μετατόπιση ενός σημαντικού μεταγραφικού παράγοντα της ηπατοκαρκινογένεσης, της β-κατενίνης, ενώ η PLIN1 επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης του ηπατοειδικού παράγοντα HNF4α. Μελέτη των ευρύτερων μοριακών δικτύων που διέπουν τη δράση της UBE2T και της PLIN1 κρίνεται αναγκαία. Η κατανόηση των σταδίων της ηπατοκαρκινογένεσης και της πολυπλοκότητάς τους αποτελεί το βήμα για πιθανές μελλοντικές θεραπευτικές παρεμβάσεις στο ΗΚΚ.