Μελέτη του λειτουργικού ρόλου του ογκοκατασταλτικού γονιδίου CYLD στον καρκίνο του μαστού

Abstract

The CYLD protein is a deubiquitinase that acts as a negative regulator of the NF-κB, JNK and p38 pathways. CYLD is predominantly a cytoplasmic protein of 956 amino acids. It contains three CAP-Gly domains at its N-terminus, that contribute to its interaction with the microtubules. The deubiquitinase catalytic domain is located at the C-terminus. CYLD was initially identified as a tumor suppressor protein that is causally associated with the development of skin appendage tumors. Since then, it has been involved in the growth suppression of different types of cancer cells, including colon, liver, lung, melanoma and breast. Its role in breast cancer is supported by its ability to inhibit the aggressive growth of BT549 breast cancer cell line by inducing apoptosis. In addition, the Cyld gene has been placed in the 5% of the major genes, whose expression levels show a significant reduction in subpopulations of breast cancer cases. This dissertation demonstrated the in vivo role of CYLD in mammary gland carcinogenesis in transgenic mice. The significant contribution of CYLD inactivation to increased and accelerated tumorigenesis in the mammary gland was shown after administration of the chemical carcinogen DMBA or the overexpression of the ErbB2 oncogene. Furthermore, the involvement of CYLD in the process of epithelial to mesenchymal transition (EMT), a process that is considered responsible for the invasion and metastasis of cancer cells as well as for resistance to chemotherapeutic approaches, was demonstrated and analyzed. The suppression of CYLD expression by RNA interference or inactivation by CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis, led to an impressive induction of the TGFβ signaling pathway and consequently to activation of the EMT program. Finally, the role of cis and trans transcription factors as well as epigenetic modifications in the regulation of CYLD expression in breast epithelial cell lines was investigated. The ability of deacetylase inhibitors as well as the PPARγ nuclear hormone receptor to induce Cyld gene transcription was observed and CYLD was identified as a mediator of troglitazone-induced cytotoxicity towards breast cancer cells lines. The results of this dissertation demonstrated the important role of CYLD in the promotion of oncogene and carcinogen-induced breast carcinogenesis as well as its involvement in signal transduction mechanisms that promote EMT. These results could be exploited for the development of new therapeutic approaches and the control of resistance in existing chemotherapeutic approaches. Moreover, the usefulness of CYLD as a potential predictive biomarker for breast cancer has emerged.

Η πρωτεΐνη CYLD είναι μία αποουβικιτινάση η οποία δρα ως αρνητικός ρυθμιστής των μονοπατιών του NF-κB, της JNK και του p38. Η CYLD είναι κυρίως μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη 956 αμινοξέων και φέρει τρεις περιοχές CAP-Gly στο αμινοτελικό της άκρο, που συμβάλλουν στην αλληλεπίδρασή της με τους μικροσωληνίσκους, καθώς και την καταλυτική περιοχή με τη δράση αποουβικιτινάσης στο καρβοξυτελικό άκρο. Η CYLD αναγνωρίστηκε αρχικά ως μία ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη που σχετίζεται αιτιολογικά με την ανάπτυξη όγκων στην επιδερμίδα. Από τότε έχει εμπλακεί στην καταστολή της αύξησης διαφορετικών τύπων καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του παχέος εντέρου, του ήπατος, του πνεύμονα, του μελανώματος και του μαστού. Σχετικά με τον καρκίνο του μαστού, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη CYLD αναστέλλει την επιθετική ανάπτυξη της καρκινικής κυτταρικής σειράς BT549, επάγοντας την απόπτωση. Επιπλέον, το γονίδιο Cyld έχει τοποθετηθεί στο 5% των κυριότερων γονιδίων, των οποίων τα επίπεδα έκφρασης παρουσιάζουν σημαντική μείωση σε υποπληθυσμούς περιπτώσεων καρκίνου του μαστού. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε in vivo ο ρόλος της CYLD στην ανάπτυξη και την καρκινογένεση του μαστικού αδένα διαγονιδιακών μυών. Διαπιστώθηκε η σημαντική συμβολή της απενεργοποίησης της CYLD στην αυξημένη και επιταχυνόμενη ογκογένεση στο μαστικό αδένα, έπειτα από τη χορήγηση του χημικού καρκινογόνου DMBA καθώς και έπειτα από την υπερέκφραση του ογκογονιδίου ErbB2. Παράλληλα, διαπιστώθηκε και αναλύθηκε η εμπλοκή της CYLD στη διαδικασία της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικής μετάβασης επιθηλιακών κυττάρων μαστού (EMT), μιας διαδικασίας που θεωρείται υπεύθυνη για την εισβολή και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων καθώς και για την ανθεκτικότητα σε χημειοθεραπευτικές προσεγγίσεις. Αναδείχθηκε ο σημαντικός ρόλος της CYLD στη συγκεκριμένη διεργασία καθώς η καταστολή της έκφρασής της μέσω RNA παρεμβολής ή με τη χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9, οδήγησε σε εντυπωσιακή επαγωγή του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ και σε ενεργοποίηση του προγράμματος της EMT. Τέλος, διερευνήθηκε ο ρόλος των cis και trans μεταγραφικών παραγόντων καθώς και των επιγενετικών τροποποιήσεων στη ρύθμιση της έκφρασης της CYLD σε επιθηλιακές κυτταρικές σειρές του μαστού. Παρατηρήθηκε σύνδεση των αναστολέων των αποακετυλασών καθώς και του πυρηνικού υποδοχέα ορμονών PPARγ με τη μεταγραφή του γονιδίου Cyld, ενώ παράλληλα η CYLD αναγνωρίστηκε ως η πρωτεΐνη μέσω της οποίας ασκεί την κυτταροτοξική του δράση στις επιθηλιακές κυτταρικές σειρές του μαστού η τρογλιταζόνη. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής κατέδειξαν το σημαντικό ρόλο της CYLD στην επαγόμενη από ογκογονίδιο ή μεταλλαξιγόνο ένωση ογκογένεση στο μαστό καθώς και την εμπλοκή της σε μηχανισμούς ρύθμισης της μεταγωγής σήματος που θα μπορούσαν να στοχευθούν για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων καθώς και για την αντιμετώπιση του φαινομένου της ανθεκτικότητας που εμφανίζεται στις ήδη υπάρχουσες χημειοθεραπευτικές προσεγγίσεις. Παράλληλα αναδείχθηκε και η ενδεχόμενη χρησιμότητα της CYLD ως δυνητικού προγνωστικού βιοδείκτη αναφορικά με τον καρκίνο του μαστού.