Γενικευμένη επιγενετική (μεθυλίωση CpG) και τρανσκριπτομική ανάλυση στις βιολογικές επιπτώσεις των βιοανθεκτικών οργανικών ρύπων (POPs) σε ανθρώπινα λευκά κύτταρα αίματος

Abstract

In this work, an extensive investigation of the potential biological effects of representative persistent organic pollutants (POPs), such as polychlorinated biphenyls (PCBs), was performed. In particular, POPs constitute a class of human-made organic compounds with pronounced persistence against chemical/biological degradation, environmental mobility, and a tendency for bioaccumulation in human and animal tissues. The primary route of POPs exposure is through oral food consumption followed by bioaccumulation in biological matrices such as adipose tissue and blood plasma, thus possessing a potential environmental and human risk. In fact, PCBs have been widely used in industry as heat transfer, dielectric and hydraulic fluids, solvent extenders, flame retardants, and organic diluents. The widespread use of PCBs, coupled with improper disposal practices, has led to significant environmental contamination by commercial PCBs formulations. In 2016, the International Agency for Research on Cancer (IARC) upgraded PCBs from the previous Group 2A “Probably carcinogenic to humans” to Group 1 “Carcinogenic to humans”; based mainly on sufficient evidence in humans of an increased risk of cutaneous malignant melanoma. PCBs have also been linked to blood-related adverse health effects such as immunosuppression, macrophage impairment and cancer, including Non-Hodgkins Lymphoma (NHL). Furthermore, PCBs have been found to have immune-toxic and pro-inflammatory, endocrine, and adverse reproductive effects, thus causing neuro-developmental anomalies, behavioral changes, and children growth deficiencies. According to recent studies, a significant relationship between PCBs and alterations on genome-wide methylation of leukocyte DNA of healthy volunteers was reported, thus providing evidence of an etiological link between the observed CpG methylation variations and chronic lymphocytic leukemia. Based on the latter, the present study aimed to elucidate the in vitro effects of PCBs in human lymphocytes’ methylome. Specifically, U937 cells and human peripheral blood monocytes (PBMCs) were exposed to different concentrations of PCB 118 (dioxin-like), PCB 153 (non-dioxin-like), as well as hexachlorobenzene (HCB) and thereafter cytotoxicity, genotoxicity and global CpG methylation analyses were performed. According to the results, all compounds currently tested did not show any consistent significant genotoxicity in all cases (time- and dose-dependent exposure). However, an extensive dose-dependent hypomethylation was observed, even at low concentrations, in stimulated PBMCs treated with PCB 118 and PCB 153 as well as a small but statistically significant hypomethylation in HCB-treated stimulated cells. Moreover, a holistic toxicogenomic study in activated and non-activated PBMCs using the InfiniumMethylEpic microarray to detect changes in CpG methylation and Next Generation sequencing for transcriptomic analysis were performed. In stimulated and non-stimulated PBMCs the differentiation from control cells follows the order PCB 153>PCB 118>HCB and PCB 118>PCB 153>HCB, respectively and thus revealed many common differentially methylated sites both between the two PCBs and between PCBs and HCB in both cellular types. The significantly low values after hypergeometric analysis suggested that the mechanisms affecting the selected POPs on CpG methylation have significant similarities. After bioinformatic analysis of genes corresponding to selected differentially methylated disease sites for both activated and non-activated PBMCs, associations were found with several types of cancer including leukemia and lymphoid leukemia as well as a variety of mental and neurocognitive disorders. Moreover, according to the analysis of differentially methylated regions, a clear enrichment of concordant genes was found, while the bioinformatic analysis showed an association with many blood cancers in both activated and non-activated PBMCs. Finally, the transcriptomic analysis showed that the non-activated PBMCs did not provide enough information to be analyzed and in the activated PBMCs a large percentage of the analyzed RNAs belong to the lncRNA category. Transcriptomic bioinformatics analysis was performed on the biological pathways affected where both PCB 118 and PCB 153 affect key interactions of cell function.

Στην παρούσα εργασία γίνεται εκτενής μελέτη των βιολογικών επιπτώσεων αντιπροσωπευτικών χημικών ουσιών/ενώσεων μιας ευρείας ομάδας περιβαλλοντικών ρύπων που είναι γνωστοί ως επίμονοι οργανικοί ρύποι ή αλλιώς POPs (Persistent Organic Pollutants). Οι POPs είναι χημικές ουσίες παγκόσμιας ανησυχίας λόγω των σημαντικών συγκεντρώσεών τους στα υδάτινα οικοσυστήματα, της ικανότητάς τους να μεταφέρονται σε μεγάλες αποστάσεις, καθώς και των σημαντικών επιπτώσεών τους στην ανθρώπινη υγεία και στο περιβάλλον. Η κύρια οδός έκθεσης σε POPs είναι μέσω της από του στόματος κατανάλωσης τροφίμων που ακολουθείται από βιοσυσσώρευση σε βιολογικές μήτρες, όπως ο λιπώδης ιστό και το πλάσμα του αίματος. Η ικανότητά τους να συσσωρεύονται μέσω της τροφικής αλυσίδας, τα καθιστά δυνητικό κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία και το περιβάλλον. Μεταξύ των POPs, τα πολυχλωριωμένα διφαινύλια (PCBs) είναι υψίστης σημασίας, μιας και χρησιμοποιήθηκαν σε εκατοντάδες βιομηχανικές και εμπορικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων ηλεκτρικών και υδραυλικών εφαρμογών, εφαρμογών μεταφοράς θερμότητας, ως πλαστικοποιητές σε χρώματα, πλαστικά, και σε πολλές άλλες. Η ευρεία χρήση των PCBs, σε συνδυασμό με ακατάλληλες πρακτικές απόρριψης, έχει οδηγήσει σε σημαντική επιβάρυνση του περιβάλλοντος από εμπορικά σκευάσματα. Το 2016, ο Διεθνής Οργανισμός Έρευνας για τον Καρκίνο (IARC) αναβάθμισε τα PCBs από την προηγούμενη Ομάδα 2Α «Πιθανώς καρκινογόνο για τον άνθρωπο» στην Ομάδα 1 «Καρκινογόνα για τον άνθρωπο» βασιζόμενοι κυρίως σε επαρκή στοιχεία για αυξημένο κίνδυνο δερματικού κακοήθους μελανώματος. Επίσης, τα PCBs έχουν συνδεθεί με ανοσοκαταστολή, βλάβη των μακροφάγων και καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου του λεμφώματος μη Hodgkin (NHL). Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι τα PCBs έχουν ανοσοτοξικές, προφλεγμονώδεις, ενδοκρινικές και αναπαραγωγικές επιπτώσεις, ενώ ευθύνονται και για νευροαναπτυξιακές ανωμαλίες, αλλαγές συμπεριφοράς και ανεπάρκειες στην ανάπτυξη των παιδιών. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ της έκθεσης σε PCBs και των αλλαγών στη μεθυλίωση του DNA σε όλο το γονιδίωμα λευκοκυττάρων υγιών εθελοντών, παρέχοντας στοιχεία που υποστηρίζουν μια αιτιολογική σχέση μεταξύ των παρατηρούμενων αλλαγών της μεθυλίωσης CpG και της χρόνιας λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας. Με βάση τα παραπάνω, η παρούσα μελέτη έχει στόχο να αποσαφηνίσει τις επιδράσεις των PCBs στη μεθυλίωση των ανθρώπινων λεμφοκυττάρων in vitro. Ως εκ τούτου, η κυτταρική σειρά U937 και μονοκύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος (PBMCs) εκτέθηκαν σε PCB-118 (ενός PCB με μορφή διοξίνης), στο PCB-153 (ενός PCB που δεν έχει τη μορφή διοξίνης) και στο εξαχλωροβενζόλιο (HCB) και έγιναν λεπτομερείς αναλύσεις κυτταροτοξικότητας, γονοτοξικότητας και CpG μεθυλίωσης. Όλες οι ενώσεις που ελέγχθηκαν δεν έδειξαν κάποια σημαντική γονοτοξικότητα σε όλες τις περιόδους έκθεσης και τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν. Αντίθετα, εκτεταμένη δοσοεξαρτώμενη υπομεθυλίωση παρατηρήθηκε, ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, σε διεγερμένα PBMCs στα οποία χορηγήθηκε PCB 118 και PCB 153, καθώς και μια μικρή αλλά στατιστικά σημαντική υπομεθυλίωση σε διεγερμένα κύτταρα με χορήγηση HCB. Στη συνέχεια, ακολούθησε ολιστική τοξικογενομική μελέτη σε ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs με χρήση της μικροσυστοιχίας InfiniumMethylEpic για να διαπιστωθούν αλλαγές στη CpG μεθυλίωση και αλληλούχηση Νέας Γενιάς για την μεταγραφομική ανάλυση. Στα ενεργοποιημένα και μη-ενεργοποιημένα PBMCs η διαφοροποίηση από τα δείγματα αναφοράς ακολουθεί την σειρά PCB 153>PCB 118>HCB και PCB 118>PCB 153>HCB, αντίστοιχα, ενώ βρέθηκαν πολλές κοινές διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις τόσο μεταξύ των δυο PCBs όσο και μεταξύ PCBs και HCB στα ενεργοποιημένα και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Οι πολύ χαμηλές τιμές σημαντικότητας μετά από υπεργεωμετρική ανάλυση υποδήλωσαν ότι οι μηχανισμοί που επιδρούν τα επιλεγμένα POPs στην CpG μεθυλίωση έχουν σημαντικές ομοιότητες. Μετά από βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων που αντιστοιχούν σε επιλεγμένες διαφορικά μεθυλιωμένες θέσεις με ασθένειες τόσο για τα ενεργοποιημένα όσο και για τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs βρέθηκαν συσχετίσεις με διάφορα είδη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων της λευχαιμίας και την λεμφοειδούς λευχαιμίας, καθώς και πληθώρα ψυχικών και νευρογνωστικών διαταραχών. Στην ανάλυση των διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών βρέθηκε σαφής εμπλουτισμός ομοιοακόλουθων γονιδίων και στην βιοπληροφορική ανάλυση συσχετισμός με μεγάλο αριθμός καρκίνων του αίματος τόσο στα ενεργοποιημένα όσο και στα μη-ενεργοποιημένα PBMCs. Η μεταγραφομική ανάλυση έδειξε ότι αρχικά τα μη-ενεργοποιημένα PBMCs στον χρόνο μελέτης δεν έχουν δώσει αρκετές πληροφορίες προς ανάλυση και στα ενεργοποιημένα PBMCs μεγάλο ποσοστό των RNAs που αναλύθηκαν ανήκουν στην κατηγορία των lncRNA. Η μεταγραφομική βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε στα βιολογικά μονοπάτια, έδειξε ότι τόσο το PCB 118 όσο και το PCB 153 επηρεάζουν βασικές αλληλεπιδράσεις της λειτουργίας των κυττάρων.