Ανάλυση των αλληλεπιδράσεων βακτηριοφάγων, βακτηρίων και επιθηλιακών κυττάρων του αναπνευστικού συστήματος μέσω ενός in vitro συστήματος μικρορευστομηχανικής

Abstract

The airway epithelium is the primary site where the inhaled and resident microbiota interact with the host and may play an important role in the development and pathophysiology of allergic asthma. With the advent of culture-independent molecular techniques and high-throughput technologies, the complex composition and diversity of respiratory bacterial communities has been well documented, and the notion of lung sterility has been definitively discarded. Recent studies indicate that the microbial composition of the airways of asthmatics differs markedly from that of healthy individuals across the spectrum of disease severity. For example, the airways of healthy individuals are reported to be dominated mainly by bacteria of the genera Prevotella (Prevotella melaninogenica, Prevotella nanceiensis, Prevotella salivae) and Veilonella (Veillonella alcalescens, Veillonella parvula, Veillonella dispar). In contrast, the bacteriome of asthmatic airways is dominated by Haemophilus (Haemophilus influenzae B, non-typeable Haemophilus influenzae), Neisseria and Moraxella catarrhalis together with Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. In parallel, there is growing body of evidence suggesting that bacterial viruses (bacteriophages or simply phages), which regulate bacterial populations, can be found in almost every niche of the human body and can interact directly with eukaryotic cells. The triptych of respiratory epithelial cells, bacterial symbionts and resident phages should be considered as a functional and interdependent entity with direct effects on respiration and general homeostasis. While the role of epithelial cells in the pathophysiology of asthma is well established, the tripartite interactions between epithelial cells, bacteria and phages should be further investigated, to better understand asthma as a system disorder and to explore potential interventions. In this study, we focused on the isolation of lytic phages for the target bacteria M. catarrhalis, A. baumannni, S. aureus and P. aeruginosa from nasopharyngeal samples from healthy donors. We have also developed a human cell-based homeostasis model between a clinically isolated strain of S. aureus 141 and active phages for this strain (PYOSa141) isolated from the commercial pyophage cocktail (PYO). The cocktail is produced by Eliava BioPreparations Ltd (Tbilisi, Georgia) and is used as an add-on therapy for bacterial infections, mainly in Georgia and Russia. For this study, the human bronchial epithelial cell line BEAS-2B and healthy primary nasal epithelial cells derived from healthy donors were selected to investigate the physiological co-existence of S. aureus 141 and PYOSa141. The focus was on mimicking a homeostasis model between S. aureus, lytic phages and airway epithelial cells and on developing novel strategies to study physical interactions of more complex systems on different in vitro culture platforms (2- or 3-dimensional systems and microfluidic systems). To construct the three-part in vitro model between bacteria, phages and airway epithelial cells, we studied each pairwise system separately by time- and dose-dependent analysis. Finally, we aimed to maintain the viability and number of each selected biological entity during triplicate culture and to evaluate the downstream physiological effect of the proposed model on cell inflammation, cell viability (apoptosis and necrosis levels), oxidative stress and cell membrane integrity by multiple time-course analyses after treatment. Inflammatory mediators (IL-8, CCL5/RANTES, IL-6 and IL-1β) were measured in the culture supernatant by enzyme-linked immunosorbent assay. The extent of cell viability and oxidative stress was estimated using flow cytometric analysis and the cytotoxic effect of the model on epithelial cells was assessed using a crystal violet staining assay. The epithelial cell integrity of differentiated nasal epithelial cells under air-liquid interface conditions was estimated by trans-epithelial electrical resistance measurements. PYOSa141 was found to have a prophylactic effect on airway epithelial cells exposed to S. aureus 141 by effectively down-regulating bacterial-induced inflammation, cytotoxicity, apoptosis levels and epithelial barrier disruption in a time-dependent manner. The effect of the triptych model on epithelial barrier protection was similar for cells cultured on 3-dimensional culture platforms and on the in-house fabricated microfluidic system. Overall, the proposed model represents an advance in the way multi-component biological systems can be simulated in vitro and further evaluated by adding more experimental parameters and using different culture platforms.

Η κεντρική ιδέα της διδακτορικής διατριβής, στηρίζεται στην in vivo αλληλεπίδραση μεταξύ των βακτηριοφάγων, των βακτηρίων και των επιθηλιακών κυττάρων της αναπνευστικής οδού, η οποία συντελεί στη διατήρηση της ομοιόστασης και συνολικής υγείας των αεραγωγών. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι, η μικροβιακή πυκνότητα και ποικιλότητα στους ασθματικούς αεραγωγούς, διαφέρει σημαντικά σε σχέση με τους υγιείς. Η επικράτηση κυρίως των βακτηρίων Haemophilus (Haemophilus influenzae B, non-typable Haemophilus influenzae), Neisseria, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Staphylococcus aureus και Pseudomonas aeruginosa στους ασθματικούς αεραγωγούς, έχει συσχετιστεί με την έξαρση των συμπτωμάτων άσθματος και πιθανά οφείλεται, μεταξύ άλλων, σε υποκείμενη έλλειψη ενεργών λυτικών βακτηριοφάγων για τα επικρατέστερα βακτηριακά είδη. Στην παρούσα μελέτη, έγινε απομόνωση λυτικών βακτηριοφάγων για τα βακτηριακά είδη M. catarrhalis, A. baumannni, S. aureus και P. aeruginosa, από ρινοφαρυγγικά δείγματα υγιών εθελοντών δοτών. Επιπλέον, οι επιμέρους αλληλεπιδράσεις μεταξύ βακτηριοφάγων, βακτηρίων και επιθηλιακών κυττάρων της αναπνευστικής οδού, διερευνήθηκαν μέσω διαφορετικών in vitro συστημάτων καλλιέργειας, προκειμένου να αναπτυχθεί το μοντέλο ομοιόστασης μεταξύ των τριών βιολογικών οντοτήτων. Βρογχικά κύτταρα BEAS-2B ή ρινικά κύτταρα που απομονώθηκαν από υγιείς εθελοντές δότες, καλλιεργήθηκαν σε δισδιάστατου ή τρισδιάστατου τύπου στατικές καλλιέργειες, καθώς και σε σύστημα μικρορευστομηχανικής διάταξης, το οποίο σχεδιάστηκε με σκοπό να προσομοιάζει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της αναπνευστικής οδού. Το τριμερές συμβιωτικό μοντέλο, αναπτύχθηκε μεταξύ των κυττάρων του αναπνευστικού συστήματος, του κλινικά απομονωμένου βακτηριακού στελέχους S. aureus 141 και των λυτικών φάγων PYOSa141, που απομονώθηκαν από το εμπορικό σκεύασμα Pyophage (PYO). Το σκεύασμα PYO παράγεται από την εταιρεία Eliava BioPreparations Ltd (Τιφλίδα, Γεωργία) και χρησιμοποιείται ως συμπληρωματική θεραπεία για την αντιμετώπιση εκτεταμένων βακτηριακών λοιμώξεων, κυρίως στις χώρες της πρώην Σοβιετικής Ένωσης. Η αξιολόγηση του προτεινόμενου in vitro συμβιωτικού μοντέλου, έγινε μέσω μέτρησης της φλεγμονώδους απόκρισης του επικείμενου επιθηλίου, των επιπέδων κυτταρικής βιωσιμότητας (επίπεδα απόπτωσης και νέκρωσης), του οξειδωτικού στρες και της ακεραιότητας του επιθηλιακού φραγμού, σε έξι διαφορετικά χρονικά σημεία που ακολούθησαν του εμβολιασμού. Η συν-επώαση βακτηριοφάγων και επιθηλιακών κυττάρων για συνολικά 16 ώρες, δεν είχε κυτταροτοξική επίδραση στην καλλιέργεια. Η παρουσία των φάγων PYOSa141 στην ίδια καλλιέργεια με τα βακτήρια S. aureus 141 και τα ανθρώπινα κύτταρα, μείωσε σημαντικά τη βακτηριακά επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και φλεγμονή. Τα επίπεδα απόπτωσης, νέκρωσης και οξειδωτικού στρες, ήταν μειωμένα στο τριμερές σύστημα καλλιέργειας σε σύγκριση με το διμερές σύστημα καλλιέργειας ανθρώπινων κυττάρων και βακτηρίων. Ο επιθηλιακός φραγμός διατηρήθηκε σε υψηλά επίπεδα τις πρώτες ώρες μετά τον εμβολιασμό στα ρινικά κύτταρα που συμμετείχαν στο τριμερές μοντέλο και καλλιεργήθηκαν στις τρισδιάστατου τύπου στατικές καλλιέργειες και στο σύστημα μικρορευστομηχανικής διάταξης. Το προτεινόμενο τριμερές συμβιωτικό μοντέλο καλλιέργειας, αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για την προσομοίωση πολύπλοκων βιολογικών συστημάτων και θέτει τις βάσεις για τη μελέτη της επίδρασης περισσότερων βιοτικών και αβιοτικών παραμέτρων στο in vitro σύστημα μικρορευστομηχανικής καλλιέργειας.