Μελέτη κολιμυκίνης σε βρέφη και παιδιά με λοιμώξεις από πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτήρια

Abstract

The wide spread of multidrug resistant Gram-negative bacteria is worrying, since the infections caused by these pathogens are related to increased morbidity and mortality, while their ability to form biofilms makes their treatment even more difficult. Colistin is a last-resort therapeutic option with high potency against multidrug resistant Gram-negative bacteria. Limited pharmacokinetic data suggest that currently recommended pediatric dosages of colistimethate sodium (CMS) by the Food and Drug Administration and European Medicines Agency may lead to suboptimal exposure, resulting in plasma colistin concentrations that are frequently < 2 μg/mL. The aim of this study was to investigate the pharmacodynamic and immunomodulatory effects of colistin against biofilms of multidrug resistant Klebsiella pneumoniae in vitro, and the pharmacokinetics of this drug in pediatric patients, at dosages higher than currently recommended. We investigated the bactericidal activities of colistin, rifampin, meropenem, gentamicin, and tigecycline alone, and that of colistin in combination with rifampin, meropenem, gentamicin, or tigecycline against carbapenem-resistant K. pneumoniae mature biofilms. Twenty carbapenem-resistant K. pneumoniae blood isolates were derived from an equal number of bloodstream infections in adult patients. Biofilm formation was assessed by crystal violet method. Biofilm damage was measured as the percent reduction of metabolic activity by XTT assay. The MIC50 for biofilms was determined as the minimum concentration that caused ≥ 50% bacterial damage compared to that for untreated controls. Antibacterial drug interactions were analyzed using the Bliss independence model. Furthemore, the interactions between colistin and innate immune cells against carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms were investigated, by studying the effect of biofilm sub-MICs of colistin on (i) damage induced by human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) on carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms and (ii) the immunomodulatory potential of human mononuclear cells (MNCs) exposed to carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms. The impact of colistin on PMN-induced biofilm damage was assessed by XTT reduction assay. Signal transduction and gene expression profiles in response to colistin sub-MICs of MNCs exposed to carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms were studied by RT-PCR and multiplex ELISA. Four of the 20 carbapenem-resistant K. pneumoniae isolates that were evaluated were biofilm producers. Biofilm MIC50s of colistin, rifampin, meropenem, gentamicin, and tigecycline for these isolates were 64, 8, > 256, 128, and 8 μg/mL, respectively. Synergistic interactions were observed at 32- 64 μg/mL of colistin combined with 0.25- 4 μg/mL of rifampin, at 32 μg/mL of colistin combined with 0.007- 0.25 μg/mL of meropenem, and at 16- 32 μg/mL of colistin combined with 16- 64 μg/mL of tigecycline. The synergy was highest for colistin plus rifampin, with a mean ΔE ± standard error (SE) of 49.87% ± 9.22%, compared to 29.52% ± 4.97% for colistin plus meropenem (p < 0.001) and 32.44% ± 6.49% for colistin plus tigecyline (p < 0.001). Indifferent interactions were demonstrated for colistin plus gentamicin. None of the combinations exhibited antagonism. Pre-exposure of carbapenem-resistant K. pneumoniae to 0.06 μg/mL of colistin led to subsequent increased PMN-mediated biofilm damage against carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms in the presence of colistin biofilm sub-MICs, with an additive effect at 2, 4, 8 and 16 μg/mL. However, the overall biofilm damage did not exceed 52%. MNCs responded to carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms through TLR2 by 2.5-fold upregulation and NLRP3 inflammasome activation. Carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms stimulated increased production of inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α, IL-8 and IL-6. In the combination treatment, 0.5 μg/mL of colistin reduced IL-1β, TNF-α and IL-8 levels, whereas at 2 μg/mL and 8 μg/mL it increased the anti-inflammatory cytokine IL-10 (p < 0.05). To evaluate pharmacokinetics (PK) of colistin in children, we conducted a population PK study in 17 critically ill patients 3 months to 13.75 years (median, 3.3 years) old who received CMS for infections caused by carbapenem-resistant Gram-negative bacteria. CMS was dosed at 200,000 IU/kg/day (6.6 mg colistin base activity [CBA]/kg/day; 6 patients), 300,000 IU/kg/day (9.9 mg CBA/kg/day; 10 patients), and 350,000 IU/kg/day (11.6 mg CBA/kg/day; 1 patient). Plasma colistin concentrations were determined using ultra performance liquid chromatography (UPLC) combined with electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). Population PK modeling of colistin in plasma was conducted using the first-order conditional estimation algorithm with interaction (FOCE+I) in NONMEM. Various parameters were recorded that could possibly be implicated in colistin PK, as well as infection- or treatment-related data. Patients were clinically and laboratory monitored for adverse events. Colistin PK was described by a one-compartment disposition model, including creatinine clearance, body weight, and the presence or absence of systemic inflammatory response syndrome (SIRS) as covariates (p < 0.05 for each). The average colistin plasma steady-state concentration (Css,avg) ranged from 1.11 to 8.47 μg/mL (median, 2.92 μg/mL). Ten patients had Css,avg of ≥ 2 μg/mL. The presence of SIRS was associated with decreased apparent clearance of colistin (47.8% of that without SIRS). The relationship between the number of milligrams of CBA per day needed to achieve each 1 μg/mL of plasma colistin Css,avg and creatinine clearance (in mL/min) was described by linear regression with different slopes for patients with and without SIRS. Nephrotoxicity, probably unrelated to colistin, was observed in one patient. In conclusion, colistin, in high doses, exhibited significant activity against carbapenem-resistant K. pneumoniae biofilms, and a remarkable synergistic effect with rifampicin, meropenem, and tigecycline. Biofilm sub-MICs of the drug improved PMNs’ killing capacity, and inhibited the excessive production of inflammatory cytokines by MNCs exposed to K. pneumoniae biofilms, emphasizing its beneficial effect on human immune cells. Regarding its use in pediatric patients, administration of CMS at the above, higher than recommended, doses improved exposure and was well tolerated. Population PK analysis identified creatinine clearance and the presence or absence of SIRS as important covariates for the apparent clearance of colistin. The development of a generalizable dosing algorithm for pediatric patients however was not feasible, as significant interpatient variability was observed when patients from previous studies were included in the analysis.

Η ευρεία εξάπλωση των πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων είναι ιδιαίτερα ανησυχητική, καθώς οι λοιμώξεις που αυτά προκαλούν σχετίζονται με αυξημένη νοσηρότητα και θνητότητα, ενώ επίσης η ικανότητά τους να δημιουργούν βιοϋμένια καθιστά ακόμη δυσκολότερη την αντιμετώπιση τους. Η κολιμυκίνη αποτελεί σήμερα ένα από τα ελάχιστα διαθέσιμα αντιβιοτικά με ισχυρή δραστικότητα έναντι πολυανθεκτικών Gram-αρνητικών βακτηρίων. Σχετικά με τη χρήση της στα παιδιά, τα περιορισμένα φαρμακοκινητικά δεδομένα δείχνουν ότι οι προτεινόμενες από τον Ευρωπαϊκο και Αμερικανικό Οργανισμό Φαρμάκων δόσεις πιθανόν να οδηγούν σε υποθεραπευτικά επίπεδα στο πλάσμα. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της φαρμακοδυναμικής και ανοσοτροποποιητικής δράσης της κολιμυκίνης έναντι βιοϋμενίων πολυανθεκτικής Klebsiella pneumoniae σε in vitro επίπεδο, καθώς και της φαρμακοκινητικής της σε παιδιατρικούς ασθενείς, σε δόσεις υψηλότερες από τις έως τώρα συνιστώμενες. Μελετήθηκε η βακτηριοκτόνος δράση της κολιμυκίνης, της ριφαμπικίνης, της μεροπενέμης, της γενταμυκίνης και της τιγεκυκλίνης, καθώς επίσης και της κολιμυκίνης σε συνδυασμό με τη ριφαμπικίνη, τη μεροπενέμη, τη γενταμυκίνη ή την τιγεκυκλίνη έναντι ώριμων βιοϋμενίων ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae. Στα πλαίσια αυτά, απομονώθηκαν 20 στελέχη από το αίμα 20 ενηλίκων ασθενών με βακτηριαιμία και εκτιμήθηκε η ικανότητα τους να δημιουργούν βιοϋμένιο, με τη μέθοδο του κρυσταλλικού ιώδους. Η καταστροφή του βιοϋμενίου από τα αντιμικροβιακά φάρμακα μετρήθηκε ως η ποσοστιαία μείωση της μεταβολικής του δραστηριότητας, μέσω της μεθόδου XTT. Η MIC50 για τα βιοϋμένια ορίστηκε ως η ελάχιστη συγκέντρωση φαρμάκου που μπορούσε να προκαλέσει ≥50% βακτηριακή καταστροφή συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (βιοϋμένιο χωρίς φάρμακο). Οι αλληλεπιδράσεις των φαρμάκων αναλύθηκαν με το μοντέλο ανεξαρτησίας του Bliss. Επιπλέον, διερευνήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην κολιμυκίνη και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι βιοϋμενίων ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae. Αυτό έγινε μελετώντας τις επιδράσεις υπο-ανασταλτικών για το βιοϋμένιο συγκεντρώσεων της κολιμυκίνης (i) στην καταστροφή που προκαλείται στα βιοϋμένια K. pneumoniae από τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, και (ii) στο ανοσοτροποιητικό δυναμικό των ανθρώπινων μονοκυττάρων που εκτέθηκαν στα βιοϋμένια αυτά. Η επίδραση της κολιμυκίνης στην καταστροφή βιοϋμενίου που προκαλείται από τα ουδετερόφιλα εκτιμήθηκε με τη μέθοδο XTT, ενώ η επίδραση της στην παραγωγή κυτταροκινών και υποδοχέων από τα μονοκύτταρα που εκτέθηκαν στα βιοϋμένια εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο ELISA και με ανάλυση RT-PCR, αντίστοιχα. Τέσσερα από τα 20 στελέχη K. pneumoniae που ελέγχθηκαν είχαν την ικανότητα να παράγουν βιοϋμένιο. Η MIC50 της κολιμυκίνης, της ριφαμπικίνης, της μεροπενέμης, της γενταμυκίνης, και της τιγεκυκλίνης για τα βιοϋμένια των στελεχών αυτών ήταν 64, 8, > 256, 128, και 8 μg/mL, αντίστοιχα. Συνεργική αλληλεπίδραση διαπιστώθηκε σε συγκεντρώσεις κολιμυκίνης 32- 64 μg/mL συνδυασμένης με 0,25- 4 μg/mL ριφαμπικίνης, στα 32 μg/mL κολιμυκίνης συνδυασμένης με 0,007- 0,25 μg/mL μεροπενέμης, και στα 16- 32 μg/mL κολιμυκίνης σε συνδυασμό με 16- 64 μg/mL τιγεκυκλίνης. Η συνέργεια ήταν μεγαλύτερη για το συνδυασμό της κολιμυκίνης με τη ριφαμπικίνη, με το μέσο ΔE ± τυπικό σφάλμα (SE) ίσο με 49,87% ± 9,22%, συγκριτικά με το συνδυασμό της κολιμυκίνης με τη μεροπενέμη και της κολιμυκίνης με την τιγεκυκλίνη, που τα αντίστοιχα ποσοστά ήταν ίσα με 29,52% ± 4,97% (p < 0,001) και 32,44% ± 6,49% (p < 0,001). Η αλληλεπίδραση της κολιμυκίνης με τη γενταμυκίνη είχε αδιάφορα αποτελέσματα, ενώ κανένας συνδυασμός δεν ήταν ανταγωνιστικός. Η προ-επώαση της ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae με 0,06 μg/mL κολιμυκίνης οδήγησε σε επακόλουθη αυξημένη καταστροφή του βιοϋμενίου από τα ουδετερόφιλα παρουσία υπο-ανασταλτικών συγκεντρώσεων κολιμυκίνης για αυτό. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε προσθετική δράση με τα ουδετερόφιλα στα 2, 4, 8, και 16 μg/mL κολιμυκίνης. Ωστόσο, η συνολική καταστροφή του βιοϋμενίου δεν ξεπέρασε το 52%. Τα μονοκύτταρα ανταποκρίθηκαν στα βιοϋμένια της ανθεκτικής στις καρβαπενέμες K. pneumoniae, μέσω αυξημένης ρύθμισης κατά 2,5 φορές της έκφρασης του TLR2 και με ενεργοποίηση του NLRP3 φλεγμονοσώματος. Τα ανθεκτικά στις καρβαπενέμες βιοϋμένια K. pneumoniae οδήγησαν σε αυξημένη παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β, TNF-α, IL-8 και IL-6. Κατά τον συνδυασμό με 0,5 μg/mL κολιμυκίνης μειώθηκαν τα επίπεδα της IL-1β, του TNF-α, και της IL-8, ενώ σε συγκεντρώσεις 2 και 8 μg/mL αυξήθηκαν τα επίπεδα της αντιφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10 (p < 0,05). Στα πλαίσια της διερεύνησης της φαρμακοκινητικής της κολιμυκίνης στα παιδιά, πραγματοποιήθηκε μια πληθυσμιακή φαρμακοκινητική μελέτη σε 17 βαρέως πάσχοντες ασθενείς ηλικίας 3 μηνών έως 13,75 ετών (διάμεση ηλικία 3,3 χρόνια), που έλαβαν άλας νατρίου μεθανοσουλφονικής κολιμυκίνης (colistimethate sodium, CMS) για λοιμώξεις που οφείλονταν σε ανθεκτικά στις καρβαπενέμες Gram-αρνητικά βακτήρια. Οι δοσολογίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 200.000 IU/kg/ημέρα (6,6 mg δραστικότητας βάσης κολιμυκίνης, colistin base activity [CBA]/kg/ημέρα) σε 6 ασθενείς, 300.000 IU/kg/ημέρα (9,9 mg CBA/kg/ημέρα) σε 10 ασθενείς, και 350.000 IU/kg/ημέρα (11,6 mg CBA/kg/ημέρα) σε έναν ασθενή. Οι συγκεντρώσεις της κολιμυκίνης στο πλάσμα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υπερυψηλής απόδοσης συνδυασμένης με φασματομετρία μάζας σε σειρά και ιοντισμό ηλεκτροψεκασμού. Η πληθυσμιακή ανάλυση των συγκεντρώσεων αυτών έγινε με μη γραμμική μικτών επιδράσεων μοντελοποίηση, με τη βοήθεια του προγράμματος ΝΟΝΜΕΜ, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της εξαρτημένης πρωτοταξικής εκτίμησης με αλληλεπίδραση (FOCE+I, first-order conditional estimation with interaction). Διάφορες παράμετροι των ασθενών που θα μπορούσαν να εμπλέκονται στη φαρμακοκινητική της κολιμυκίνης καταγράφονταν, καθώς επίσης και δεδομένα σχετιζόμενα με τις λοιμώξεις και την αντιμετώπιση τους. Οι ασθενείς παρακολουθούνταν κλινικά και εργαστηριακά για την πιθανή εμφάνιση ανεπιθύμητων ενεργειών. Η φαρμακοκινητική της κολιμυκίνης περιγράφηκε με ένα μονο-διαμερισματικό μοντέλο κατανομής, που περιελάμβανε σαν μεταβλητές την κάθαρση της κρεατινίνης, το σωματικό βάρος, και την παρουσία ή απουσία συνδρόμου συστηματικής φλεγμονώδους απόκρισης (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) (p < 0,05 για την καθεμία). Η μέση συγκέντρωση σταθερής κατάστασης της κολιμυκίνης στο πλάσμα (Css,avg) κυμάνθηκε από 1,11 έως 8,47 μg/mL (διάμεση τιμή 2,92 μg/mL). Δέκα ασθενείς είχαν Css,avg ≥ 2 μg/mL. Η παρουσία SIRS σχετίζονταν με μειωμένη φαινομενική κάθαρση της κολιμυκίνης (47,8% εκείνης χωρίς SIRS). Η σχέση ανάμεσα στον αριθμό των mg CBA/ημέρα που απαιτούνται για να επιτευχθεί κάθε 1 μg/mL της Css,avg της κολιμυκίνης στο πλάσμα και της κάθαρσης της κρεατινίνης (σε mL/min) περιγράφηκε με γραμμική παλινδρόμηση με διαφορετικές κλίσεις για ασθενείς με και χωρίς SIRS. Νεφροτοξικότητα, πιθανά μη σχετιζόμενη με την κολιμυκίνη, παρατηρήθηκε σε έναν ασθενή. Συμπερασματικά, η κολιμυκίνη, σε υψηλές ωστόσο συγκεντρώσεις, παρουσίασε σημαντική δραστικότητα έναντι των βιοϋμένιων K. pneumoniae, και αξιοσημείωτη συνεργική δράση με τη ριφαμπικίνη, τη μεροπενέμη και την τιγεκυκλίνη. Σε υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις αφενός αύξησε την ικανότητα θανάτωσης των ουδετεροφίλων και αφετέρου ανέστειλε την υπερβολική παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών από τα μονοκύτταρα που εκτέθηκαν στα βιοϋμένια της K. pneumoniae, υπογραμμίζοντας την ευεργετική της δράση για τα κύτταρα του ανοσιακού μας συστήματος. Όσον αφορά τη χρήση της στα παιδιά, διαπιστώθηκε ότι οι υψηλότερες δόσεις του CMS που χορηγήθηκαν ήταν καλά ανεκτές και οδήγησαν σε βελτιωμένη έκθεση. Η πληθυσμιακή φαρμακοκινητική ανάλυση επισήμανε την κάθαρση της κρεατινίνης και την παρουσία SIRS ως κύριους παράγοντες που επηρεάζουν τη φαινομενική κάθαρση της κολιμυκίνης και επομένως τα επίπεδα της στο πλάσμα. Η ανάπτυξη ενός δοσολογικού αλγορίθμου δεν ήταν εφικτή καθώς διαπιστώθηκε ευρεία μεταβλητότητα όταν συμπεριλήφθηκαν και ασθενείς προηγούμενων μελετών.