Φυτοχημική μελέτη φυτών με παραδοσιακή διουρητική ή/και επουλωτική δράση

Abstract

Background and Aim: Over the last decades, the research community has studied with interest plants and natural products as a basis for the design and development of new drugs for the treatment of various diseases, mainly cancer and cardiovascular disease, which are the two leading causes of death worldwide. Trying to reveal the great importance of the plants of our country with beneficial properties and high ethnopharmacological significance, the present study aims to: (a) isolate and identify the specialised products of Asplenium ceterach L. (rustyback) extracts, as well as investigate the effects of the traditional A. ceterach decoction in an experimental model of atherosclerosis in mice in order to highlight any beneficial properties for the cardiovascular system & (b) the bio-guided isolation and identification of the specialised products of Sideritis euboea Heldr. (mountain tea) for their cytotoxic activity, as well as for their possible inhibitory activity against hyaluronidase.Methods: A. ceterach L.: The plant material was successively extracted with cyclohexane, dichloromethane and methanol. Part of the methanol extract was submitted to Charaux-Paris process, then was concentrated and the residue re-dissolved in boiling water. The water-soluble fraction was filtered and extracted with ethyl acetate and n-butanol successively. In addition, part of the cyclohexane extract was submitted to Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) technique and to 1D- NMR (1 Dimensional- Nuclear Magnetic Resonance) experiment. The fractionations of the methanol extract, the ethyl acetate and n-butanol residues were done by various techniques such as MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) VLC (Vacuum Liquid Chromatography), CC (Column Chromatography), TLC (Thin Layer Chromatography), HPLC (High Performance Liquid Chromatography). 1D- & 2D- NMR experiments were used for the structure elucidation of the isolated compounds. The traditional decoction of A. ceterach was studied in an animal model of atherosclerosis for 8 weeks. 24 adult male mice (Mus musculus) SV129 wild type (wt) and 24 adult male mice PPAR-Alpha knock out (PPARa -/-) SV129 were randomly allocated into three groups per breed: Atheromatosis group (n=8), Atheromatosis + Rustyback group (n=8) and Control group (n=8). The two first groups received high fat diet for 8 weeks. Rustyback decoction was given orally as an aqueous solution in a daily dose. Body weight and serum biochemical parameters were determined at baseline, at 4 and 8 weeks. Moreover, at the baseline and at the end-point endocardiography analysis were performed. At the end of the study, a histopathological assessment was also carried out.S. euboea Heldr.: The plant material (originated from cultivated populations) was successively extracted with cyclohexane, dichloromethane, and methanol. Extraction and fractionation methods were the same as described above. 1D- & 2D- NMR experiments were used for the structure elucidation of the isolated compounds. The cytotoxic potential was evaluated, using the MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) assay on three human cancer cell lines DLD1, HeLa, and A549. The range of the examined concentrations was at 0-100 μM for 72h. In addition, the ethyl acetate residue and its isolated compounds were evaluated in silico and in vitro for their inhibitory activity against hyaluronidase. The activity of hyaluronidase was determined through UV spectroscopy based on Morgan-Elson method. The examined in vitro concentrations were 300 μg/mL and 500 μg/mL. Results: A. ceterach L.: Overall, 14 natural compounds were isolated, belonging to flavonoids (compounds 1-4) and phenolic derivatives/ precursor metabolites (compounds 5-14). In the cyclohexane extract, the presence of ethyl esters of palmitic, linoleic and α-linolenic acids was detected. The results of the in vivo study show that: (a) the experimental model used for the development of atheromatosis is efficient since changes of their weight, as well as glucose, cholesterol, LDL cholesterol and triglycerides levels’ were observed in both mice types and (b) the endocardiography data provide evidence that the decoction of rustyback maintains stable the overall image of the mice when compared to the atheromatosis group and the baseline measurement. S. euboea Heldr.: In total, 48 natural products were isolated which were categorized into phytosterols (compounds 1-3), triterpenes (compound 4), diterpenoids (compounds 5-8), iridoids (compounds 9-12), flavonoids (compounds 13-27), lignans/neolignans (compounds 28 & 29), phenylethanoid glycosides (compounds 30-37), phenolic acids (compounds 38-46) and lipid acid derivatives (compounds 47 & 48). The IC50 values of siderol in DLD1, HeLa, and A549 cells were 26.4 ± 3.7 μΜ (DLD1), 44.7 ± 7.2 μΜ (HeLa) and 46.0 ± 4.9 μΜ (A549). The diterpenoid showed an enhanced cytotoxic effect on the DLD1 cell line compared to HeLa and A549 cells, where siderol’s IC50 values were almost two-fold the IC50 value in the DLD1.The compound apigenin-7-Ο-β-D-glucopyranoside and its acylated derivatives showed the most optimum binding profile in silico. Compounds apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside, apigenin-7-O-[4''-O-Ζ-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside, apigenin 7-O-[6''-O-Ε-p- coumaroyl]-β-D-glucopyranoside demonstrated enhanced in silico binding affinities to hyaluronidase, as well as compounds 4'-methyl-hypolaetin 7-O-[6'''-O-acetyl-β-D-allopyranosyl]-(1→2)-β-D-glucopyranoside and 4'-methyl-hypolaetin 7-O-[6'''-O-acetyl-β-D- allopyranosyl]-(1→2)-6''-O-acetyl-β-D-glucopyranoside (moderate binding affinity in silico) and the ethyl acetate residue were evaluated in vitro for their anti-hyaluronidase activity. The EtOAc crude extract of S. euboea showed weak inhibition at a concentration of 300 μg/mL, with a value of 18.55 ± 0.12%, whereas at 500 μg/mL, it showed moderate inhibition with a value of 35.67 ± 0.15%. The apigenin 7-Ο-β-D-glucopyranoside, exhibited moderate inhibition (34.84 ± 0.08%) at a concentration of 300 μg/mL and very good inhibitory activity (64.77 ± 0.06%) at a concentration of 500 μg/mL. Apigenin 7-O-[4''-O-Ζ-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside and apigenin 7-O-[6''-O-Ε-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside showed weaker activity at a concentration of 300 μg/mL (11.77 ± 0.06% and 0.8 ± 0.15%, respectively). However, at a concentration of 500 μg/mL apigenin 7-O-[4''-O-Ζ-p-coumaroyl]-β-D-glucopyranoside inhibited hyaluronidase with a value of 34.17 ± 0.08%. Between the two hypolaetin 7-O-allosylglucoside derivatives, which were studied for their anti-hyaluronidase potency, 4'-methyl-hypolaetin 7-O-[6'''-O-acetyl-β-D-allopyranosyl]-(1→2)-β-D-glucopyranoside showed weak inhibitory activity (7.26 ± 0.11%) at concentration of 300 μg/mL, whereas at concentration of 500 μg/mL, the inhibition was moderate with a value of 35.67 ± 0.06%. On the contrary, 4'-methyl-hypolaetin 7-O-[6'''-O-acetyl-β-D-allopyranosyl]-(1→2)-6''-O-acetyl-β-D-glucopyranoside showed weak inhibitory activity at the same concentration (500 μg/mL, 10.96 ± 0.21%). Conclusions: The present study reveals the importance of two plants of Greek Flora (A. ceterach L. & S. euboea Heldr.) with high ethnopharmacological significance. Regarding the phytochemical investigation of the two plants:-14 natural products were isolated of which 10 are isolated for the first time from A. ceterach L. and 6 of them are mentioned for the first time in genus Asplenium L. -48 natural products were isolated of which 33 are isolated for the first time from S. euboea Heldr and 10 are mentioned for the first time in genus Sideritis L. As a result, this study importantly contributes to the chemotaxonomy of genus Asplenium L. and Sideritis L. Given that the plant material of S. euboea was originated from cultivated populations, it should be mentioned that this study indicates that the cultivation for this species is feasible, providing plants with rich phytochemical profiles.Regarding the in vivo study of the decoction of A. ceterach, the present study is the first report on the investigation of this traditional decoction in an animal model of atheromatosis (mice), examining a potential mode of action on the lipid metabolism, glucose and inflammation control through PPARa receptors. Specifically, the results provide evidence that the traditional decoction might play a protective role in the progress of the disease by stabilising or delaying its development. However, further studies are essential to clarify the mechanism of action, dosage and possible side effects. Importantly, this study confirms the use of this plant as an anti-inflammatory and diuretic agent in folk medicine.Regarding the in vitro studies of S. euboea, the present study consists the first report on the cytotoxic activity of siderol which is one of the major compounds of genus Sideritis L., unveiling its beneficial potential as a remarkable cytotoxic agent. Furthermore, the in silico and in vitro studies revealed the potent inhibitory properties of the ethyl acetate residue of S. euboea and its isolated compounds. This research represents the first study on the antihyaluronidase activity of Sideritis species, confirming its anti-inflammatory, cytotoxic and anti-ageing effects, and its importance as an agent for cosmetic formulations as also anticancer potential.In the end, the aforementioned results confirm the traditional uses of genus Sideritis L. as an anti-inflammatory agent.

Εισαγωγή & Σκοπός: Η ερευνητική κοινότητα, ιδιαίτερα τα τελευταία χρόνια, μελετά με ενδιαφέρον φυτά και φυσικά προϊόντα ως βάση για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών σκευασμάτων για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών και κυρίως του καρκίνου και των καρδιαγγειακών παθήσεων που αποτελούν τις δύο κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Προσπαθώντας να αναδείξουμε τη μεγάλη σημασία των φυτών της χώρας μας με ευεργετικές ιδιότητες και υψηλής εθνοφαρμακολογικής σημασίας, προέκυψε η παρούσα διδακτορική διατριβή, που αφορά: (α) την απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών των εκχυλισμάτων του Asplenium ceterach L. (κν. σκορπίδι), καθώς και τη διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο επιδρά το παραδοσιακό αφέψημα του A. ceterach σε πειραματικό μοντέλο αθηρωμάτωσης σε μύες με σκοπό την ανάδειξη τυχόν ευεργετικών ιδιοτήτων για το καρδιαγγειακό σύστημα & (β) τη βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών του Sideritis euboea Heldr. (τσάι του βουνού) ως προς την κυτταροτοξική τους δράση, καθώς και για την πιθανή ανασταλτική τους δράση έναντι της υαλουρονιδάσης.Μέθοδοι: A. ceterach L.: Η δρόγη εκχυλίστηκε διαδοχικά με κυκλοεξάνιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Μέρος του μεθανολικού εκχυλίσματος υποβλήθηκε στη μέθοδο Charaux-Paris κατά την οποία παραλήφθηκαν υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα, υπόλειμμα βουτανόλης και υδατικό υπόλειμμα. Μικρή ποσότητα από το κυκλοεξανικό εκχύλισμα της δρόγης υποβλήθηκε σε αέριο υγρο-χρωματογραφία συζευγμένη με φασματογράφο μάζης (GC-MS), καθώς επίσης και σε φασματοσκοπική εξέταση (1H-NMR). Επιπρόσθετα, μελετήθηκε το αρχικό μεθανολικό εκχύλισμα, καθώς και τα υπολείμματα οξικού αιθυλεστέρα και βουτανόλης. Η κλασματοποίησή τους για την παραλαβή των δραστικότερων μεταβολιτών έγινε με τη χρήση διαφόρων τεχνικών όπως MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) VLC (Vacuum Liquid Chromatography), CC (Column Chromatography), TLC (Thin Layer Chromatography), HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Η ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων 1D- & 2D- NMR (Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού).Για τη διερεύνηση του παραδοσιακού αφεψήματος από το σκορπίδι σε πειραματικό μοντέλο αθηρωμάτωσης χρονικής διάρκειας 8 εβδομάδων, επιλέχθηκαν 24 αρσενικοί μύες (Mus musculus) SV129 άγριου τύπου (wild type-wt) και 24 διαγονιδιακοί μύες με αποσιωπημένο το γονίδιο του PPAR-Alpha (PPARa -/-) σε γενετικό υπόβαθρο SV129 που μελετήθηκαν για χρονικό διάστημα 8 εβδομάδων. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες ομάδες: Ομάδα Α (Αθηρωμάτωσης), Β (Αθηρωμάτωσης + Σκορπίδι) και Γ (control1-υγιείς μάρτυρες) με 8 αρσενικούς μύες wt η κάθε μία, καθώς και Ομάδα Δ (Αθηρωμάτωσης), Ε (Αθηρωμάτωσης + Σκορπίδι) και Ζ (control2-υγιείς μάρτυρες) με 8 αρσενικούς PPARa -/- μύες η κάθε ομάδα. H αθηρωμάτωση σε όλες τις ομάδες επετεύχθη με χορήγηση δίαιτας υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (45% λίπος) για χρονικό διάστημα 8 εβδομάδων. Το παραδοσιακό αφέψημα από το σκορπίδι χορηγήθηκε στους μύες σε μορφή υδατικού διαλύματος. Στην αρχή της μελέτης, καθώς και έπειτα από 4 εβδομάδες και στο τέλος του πειράματος πραγματοποιήθηκε μέτρηση σωματικού βάρους, μέτρηση γλυκόζης και αιμοληψία. Επίσης, στην αρχή και στο τέλος της πειραματικής μελέτης πραγματοποιήθηκε και υπερηχογραφική εξέταση. Στο τέλος της πειραματικής μελέτης, έγινε ευθανασία των πειραματοζώων και πραγματοποιήθηκε ανάλυση βιοχημικών παραμέτρων, καθώς επίσης η αορτή, η καρδιά, το ήπαρ και οι νεφροί εξετάστηκαν και εκτιμήθηκαν παθολογοανατομικά. S. euboea Heldr.: Η δρόγη (προέλευση: καλλιεργημένοι πληθυσμοί) εκχυλίστηκε διαδοχικά με κυκλοεξάνιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Μέρος του μεθανολικού εκχυλίσματος υποβλήθηκε στη μέθοδο Charaux-Paris κατά την οποία παραλήφθηκαν υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα, υπόλειμμα βουτανόλης και υδατικό υπόλειμμα. Μελετήθηκε το διχλωρομεθανικό εκχύλισμα, καθώς και τα υπολείμματα οξικού αιθυλεστέρα και βουτανόλης. Η κλασματοποίησή τους για την παραλαβή των δραστικότερων μεταβολιτών έγινε με τη χρήση διαφόρων τεχνικών όπως προαναφέρθηκε. Η ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων 1D- & 2D- NMR.H κυτταροτοξική δράση μελετήθηκε έναντι τριών ανθρώπινων καρκινικών σειρών (DLD1, HeLa, A549) εφαρμόζοντας τη μέθοδο MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide). Το εύρος των συγκεντρώσεων της ουσίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0-100 μΜ για 72 ώρες. Οι απομονωμένες ουσίες από το υπόλειμμα του οξικού αιθυλεστέρα υποβλήθηκαν σε in silico μελέτη έναντι του ενζύμου υαλουρονιδάσης. Στη συνέχεια, οι ουσίες που έδειξαν ισχυρή και μέτρια πρόσδεση στο συγκεκριμένο ένζυμο στην in silico μελέτη, καθώς και το αρχικό κλάσμα (υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα) μελετήθηκαν in vitro με σκοπό να αξιολογηθεί η δράση τους έναντι της υαλουρονιδάσης. Η μελέτη της δράσης της υαλουρονιδάσης με φασματοσκοπία UV, έγινε βάσει της μεθόδου των Morgan-Elson. Οι συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν ήταν 300 μg/mL και 500 μg/mL. Για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων των ουσιών (που αξιολογήθηκαν in vitro) με το ένζυμο της υαλουρονιδάσης πραγματοποιήθηκε in silico docking. Αποτελέσματα:A. ceterach L.: Συνολικά, απομονώθηκαν 14 φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στα φλαβονοειδή (ουσίες 1-4) και στα παράγωγα των φαινολικών οξέων και πρόδρομων ενώσεών τους (ουσίες 5-14). Στο κυκλοεξανικό εκχύλισμα της δρόγης εντοπίστηκε η παρουσία αιθυλεστέρα του παλμιτικού οξέος, του λινελαϊκού οξέος και του α-λινολενικού οξέος.Από τα αποτελέσματα της in vivo μελέτης προκύπτουν τα εξής: (α) το πειραματικό μοντέλο για τη δημιουργία αθηρωμάτωσης είναι αποτελεσματικό καθώς παρατηρήθηκαν και στους δύο τύπους πειραματοζώων μεταβολές στο σωματικό βάρος, στα επίπεδα γλυκόζης αίματος, χοληστερόλης, LDL χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων. και (β) από το σύνολο των υπερηχογραφικών δεδομένων διαπιστώνεται ότι το αφέψημα από το σκορπίδι διατηρεί σταθερή την εικόνα του ζώου σε σχέση με την ομάδα αθηρωμάτωσης, αλλά και την baseline μέτρηση. S. euboea Heldr.: Συνολικά, απομονώθηκαν 48 φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στις εξής χημικές κατηγορίες: φυτοστερόλες (ουσίες 1-3), τριτερπένιο (ουσία 4), διτερπενοειδή (ουσίες 5-8), ιριδοειδή (ουσίες 9-12), φλαβονοειδή (ουσίες 13-27), λιγνάνια/νεολιγνάνια (ουσίες 28 & 29), φαινυλοαιθανοειδείς γλυκοσίδες (ουσίες 30-37), φαινολικά οξέα (ουσίες 38-46) και παράγωγα λιπαρών οξέων (ουσίες 47 & 48). Στην in vitro κυτταροτοξική μελέτη, η σιδερόλη σε συγκεντρώσεις 100 και 50 μΜ εμφάνισε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση και στις τρεις καρκινικές σειρές. Οι τιμές IC50 ήταν 26.4 ± 3.7 μΜ (DLD1), 44.7 ± 7.2 μΜ (HeLa) και 46.0 ± 4.9 μΜ (A549). Το διτερπενοειδές έδειξε αξιοσημείωτη κυτταροτοξική δράση στην καρκινική σειρά DLD1 σε σύγκριση με τις άλλες δύο καρκινικές σειρές στις οποίες οι τιμές IC50 ήταν σχεδόν διπλάσιες από εκείνη που εμφάνισε στα DLD1 κύτταρα.Ο απιγενινο-7-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και τα ακυλιωμένα παράγωγά του παρουσίασαν την ισχυρότερη πρόσδεση με το ένζυμο της υαλουρονιδάσης στην in silico μελέτη. Οι ουσίες απιγενινο 7-O-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, απιγενινο 7-O-[6''-O-Ε-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης που έδειξαν ισχυρή πρόσδεση στην in silico μελέτη, καθώς επίσης και οι ουσίες 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-6''-O-ακετυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (μέτρια πρόσδεση in silico) και το αρχικό κλάσμα (υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα) μελετήθηκαν in vitro έναντι της υαλουρονιδάσης. To υπολειμμα του οξικού αιθελεστέρα στη συγκέντρωση 300 μg/mL έδειξε χαμηλή ανασταλτική ικανότητα (18.55 ± 0.12%), ενώ σε 500 μg/mL, παρουσίασε μέτρια ανασταλτική ικανότητα (35.67 ± 0.15%). Ο απιγενινο-7-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, εμφάνισε μέτρια ανασταλτική δράση (34.84 ± 0.08%) σε συγκέντρωση 300 μg/mL και ισχυρή ανασταλτική δράση (64.77 ± 0.06%) σε συγκέντρωση 500 μg/mL. Τα απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και απιγενινο 7-O-[6''-O-Ε-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης εμφάνισαν χαμηλή δράση σε συγκέντρωση 300 μg/mL (11.77 ± 0.06% και 0.8 ± 0.15%, αντίστοιχα). Όμως, σε συγκέντρωση 500 μg/mL ο απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης ανέστειλε τη δράση της υαλουρονιδάσης σε ποσοστό 34.17 ± 0.08%. Μεταξύ των δύο παραγώγων υπολαετίνης που μελετήθηκαν, ο 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδης παρουσίασε χαμηλή δράση (7.26 ± 0.11%) σε συγκέντρωση 300 μg/mL, ενώ σε συγκέντρωση 500 μg/mL, η δράση του ήταν μέτρια 35.67 ± 0.06%. Αντίθετα, ο 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-6''-O-ακετυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης έδειξε χαμηλή αναστολή στην ίδια συγκέντρωση (500 μg/mL, 10.96 ± 0.21%). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη αναδεικνύει τη μεγάλη σημασία δύο φυτών της Ελληνικής χλωρίδας (Asplenium ceterach L. & S. euboea Heldr.) με υψηλή εθνοφαρμακολογική σημασία. Όσον αφορά τη φυτοχημική μελέτη των δύο φυτών, απομονώθηκαν:-14 φυσικά προϊόντα εκ των οποίων τα 10 απομονώνονται για πρώτη φορά στο A. ceterach L. και από αυτά τα 6 αναφέρονται για πρώτη φορά στο γένος Asplenium L. -48 φυσικά προϊόντα εκ των οποίων 33 απομονώνονται για πρώτη φορά στο S. euboea Heldr και 10 απομονώνονται για πρώτη φορά στο γένος Sideritis L. Συνεπώς, η συγκεκριμένη μελέτη συμβάλλει σημαντικά και στη χημειοταξινομία των γένων Asplenium L. και Sideritis L. Δεδομένου ότι το φυτικό υλικό του S. euboea προήλθε από καλλιεργημένους πληθυσμούς, αξίζει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης δείχνουν ότι η καλλιέργεια του συγκεκριμένου είδους είναι εφικτή παρέχοντας ένα πλούσιο φυτοχημικό προφίλ.Όσον αφορά την in vivo μελέτη του αφεψήματος του A. ceterach, η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη διερεύνηση του παραδοσιακού αφεψήματος από το σκορπίδι σε μοντέλο αθηρωμάτωσης (μύες), εξετάζοντας έναν πιθανό μηχανισμό δράσης του στο μεταβολισμό των λιπιδίων, της γλυκόζης και τον έλεγχο της φλεγμονής μέσω των PPARa υποδοχέων. Συνεπώς, η αρχική υπόθεση ότι το σκορπίδι μπορεί να εμπλέκεται στην εξέλιξη της νόσου φαίνεται να επιβεβαιώνεται από όλα τα δεδομένα της μελέτης. Συγκεκριμένα, προκύπτουν ενδείξεις ότι το παραδοσιακό αφέψημα από το σκορπίδι εμφανίζει προστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου καθώς φαίνεται ότι σταθεροποιεί ή επιβραδύνει την εξέλιξή της. Ωστόσο περισσότερες μελέτες χρειάζονται να πραγματοποιηθούν για να αποσαφηνίσουν τον μηχανισμό δράσης, τη δοσολογία και τις πιθανές ανεπιθύμητες ενέργειες. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συγκεκριμένη μελέτη επιβεβαιώνει τη χρήση του συγκεκριμένου φυτού ως αντιφλεγμονώδη και διουρητικό παράγοντα στη λαϊκή θεραπευτική. Όσον αφορά τα in vitro πειράματα για το S. euboea, η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά για την κυτταροτοξική δράση της σιδερόλης η οποία αποτελεί μία από τις κύριες ουσίες του γένους Sideritis L., αναδεικνύοντας την ως σημαντικό κυτταροτοξικό παράγοντα. Επιπρόσθετα, οι in silico και in vitro μελέτες για την ανασταλτική δράση έναντι της υαλουρονιδάσης του εκχυλίσματος και των απομονωμένων φυσικών προϊόντων από το S. euboea αποκάλυψαν την αξιόλογη δράση κυρίως των παραγώγων απιγενίνης. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη αναφορά για την ανασταλτική δράση του τσάι του βουνού στο συγκεκριμένο ένζυμο, αναδεικνύοντας το ως αντιγηραντικό, αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινικό παράγοντα. Συνεπώς, τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τις παραδοσιακές χρήσεις του γένους Σιδηρίτη ως παράγοντα για την αντιμετώπιση φλεγμονών.