Μελέτη της αερόβιας και αναερόβιας μικροχλωρίδας αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών

Abstract

In recent years, the interest of researchers in the epiphytic flora has revived. The dynamics of plant populations that colonize plants, which is estimated by recording their species and populations, has led, after decades of inactivity, to the search for factors that affect epiphytic populations and to the formation of new perspectives on the interaction of plant and microorganisms. Now, researchers accept that epiphytic bacteria are an analogue of the human microbiome that affect and are affected by the plant species they colonize. In this context, in the present thesis we studied the species and the population of the epiphytic flora of 228 samples from 36 aromatic-medicinal plants of Greece which were available from local markets and producers. The study included the use of standard microbiological techniques i.e. decimal dilutions, plating in suitable culture media and proper incubation, followed by colonies counting. The groups of microbes we focused on were the total viable count as well as Escherichia coli, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Clostridium perfringens, Bacillus spp., Enterococcus spp., as well as molds & yeasts. The results showed the presence of rich microflora not only in terms of species but also in terms of populations as up to 6 million microbial cells were counted in one gram of dry plant tissue. The species Bacillus spp., 17 Enterococcus spp. and Pseudomonas spp. were observed at a lower frequency while the rest were abundant in almost all samples examined. The analysis did not show that the populations may follows a specific distribution such as the log-normal which has been observed in vegetables or cultivated plants of commercial importance. In addition, during this study, a large number of isolated bacteria have been tested for sensitivity to the essential oil of oregano and thyme through the assessment of Minimum Inhibitory Concentration by the micro-dilution method. The aim was to test any increased resistance of these microbes as a result of adaptation to the microenvironment of the surface of aromatic-medicinal plants. The results showed that to a statistically significant degree the minimal inhibitory concentrations of E. coli, Pseudomonas spp., C. perfringens, Bacillus spp., and Enterococcus spp., tested with oregano essential oil, were higher than those of our previous research and bibliographic data. Similarly, the Minimum inhibitory Concentrations of E. coli, Pseudomonas spp., and Bacillus spp. which were tested in thyme essential oil were statistically larger than those of either of either our earlier studies or bibliographic data. Considering that the oregano and thyme essential oils we used in our experiments to estimate the minimum inhibitory concentration were rich in active compounds such as carvacrol (77%) and thymol (47.4%) and therefore sufficiently active, we consider as probable the view of an increased resistance of the epiphytic microorganisms against essential oils. Although further research is needed, a possible adaptation of microorganisms to the essential oils would require a review of their usefulness as potential alternatives to conventional antibiotics

Τα τελευταία χρόνια έχει αναθερμανθεί το ενδιαφέρον των ερευνητών για την επιφυτική χλωρίδα. Η δυναμική των πληθυσμών μικροβίων που αποικίζουν τα φυτά η οποία εκτιμάται με την καταγραφή του είδους και του αριθμού τους έχει οδηγήσει μετά από δεκαετίες αδράνειας, στην αναζήτηση των παραγόντων που επηρεάζουν τους επιφυτικούς πληθυσμούς και στην διαμόρφωση νέων απόψεων για την αλληλεπίδραση φυτών μικροοργανισμών. Πλέον, οι ερευνητές δέχονται ότι τα επιφυτικά βακτήρια αποτελούν ένα ανάλογο του ανθρώπινου μικροβιώματος που επηρεάζουν και επηρεάζονται από το φυτικό είδος που αποικίζουν. Στα πλαίσια αυτά στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήσαμε το είδος και τον πληθυσμό της επιφυτικής χλωρίδας 228 δειγμάτων από 36 αρωματικά-φαρμακευτικά φυτά της Ελλάδας τα οποία ήταν διαθέσιμα από λαϊκές αγορές και παραγωγούς. Η μελέτη περιλάμβανε την χρήση κλασικών μικροβιολογικών τεχνικών όπου μετά από δεκαδικές αραιώσεις σε αραιωτικό μέσο ακολούθησε επίστρωση σε τρυβλία με κατάλληλα καλλιεργητικά υλικά, επώαση και καταγραφή των αποικιών που αναπτύχθηκαν. Οι ομάδες των μικροβίων στα οποία επικεντρωθήκαμε ήταν η ολική μεσόφιλη χλωρίδα όπως και το Escherichia coli, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Clostridium perfringens, Bacillus spp., Enterococcus spp., καθώς και οι ζυμομύκητες. Τα αποτελέσματα έδειξαν την παρουσία πλούσιας μικροχλωρίδας όχι μόνο από πλευράς ειδών, αλλά και από πλευράς πληθυσμών δεδομένου ότι καταμετρήθηκαν έως και 6 εκατομμύρια μικροβιακά κύτταρά σε ένα γραμμάριο ξηρού φυτικού ιστού. Τα είδη Bacillus spp., Enterococcus spp. και Pseudomonas spp. παρατηρήθηκαν σε μικρότερη συχνότητα ενώ τα υπόλοιπα καταμετρήθηκαν σχεδόν σε όλα τα δείγματα που εξετάσθηκαν. Ο έλεγχος δεν έδειξε πως οι επιφυτική πληθυσμοί ακολουθούν κάποια συγκεκριμένη κατανομή όπως για παράδειγμα την λογαριθμοκανονική η οποία έχει παρατηρηθεί σε λαχανικά ή καλλιεργούμενα φυτά με υψηλή εμπορική σημασία. Επιπρόσθετα στην παρούσα διατριβή, ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων βακτηρίων εξετάσθηκε ως προς την ευαισθησία τους στο αιθέριο έλαιο της ρίγανης και του θυμαριού μέσω της εκτίμησης της Ελάχιστης Ανασταλτικής Συγκέντρωσης με την μέθοδο της μικρο-αραίωσης. Σκοπός ήταν να ελεγχθεί η αυξημένη ανθεκτικότητα των μικροβίων αυτών σαν αποτέλεσμα προσαρμογής στο μικροπεριβάλλον της επιφάνειας των αρωματικών-φαρμακευτικών φυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε στατιστικά σημαντικό βαθμό οι Ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις των E. coli, Pseudomonas spp., C. perfringens, Bacillus spp., και Enterococcus spp., που ελέγχθηκαν στο αιθέριο έλαιο της ρίγανης ήταν μεγαλύτερες από αυτές προγενέστερων δικών μας ερευνών, βιβλιογραφικών δεδομένων αλλά και των πρότυπων στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν. Ομοίως, οι ελάχιστες ανασταλτικές συγκεντρώσεις των E. coli, Pseudomonas spp., και Bacillus spp. που ελέγχθηκαν σε αιθέριο έλαιο θυμαριού ήταν στατιστικά μεγαλύτερες από αυτές είτε παλαιότερων δικών μας μελετών ή βιβλιογραφικών δεδομένων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα αιθέρια έλαια ρίγανης και θυμαριού που χρησιμοποιήσαμε στους πειραματισμούς για την εκτίμηση της ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης, ήταν πλούσια σε δραστικές ενώσεις όπως η καρβακρόλη (77%) και η θυμόλη (47,4%) και άρα αρκούντος δραστικές, θεωρούμε πως έχει βάση η άποψη για την αυξημένη ανθεκτικότητα των μικροοργανισμών της επιφυτικής χλωρίδας έναντι των αιθέριων ελαίων. Αν και απαιτείται περεταίρω έρευνα, μια ενδεχόμενη προσαρμογή των μικροοργανισμών στην δράση των αιθέριων ελαίων θα απαιτούσε την επανεξέταση της χρησιμότητάς τους σαν δυνητικά εναλλακτικά των κλασικών αντιβιοτικών