Σχεδιασμός, σύνθεση και αξιολόγηση νανοσωματιδίων με εγκλωβισμό πεπτιδίων των πρωτεινών της μυελίνης

Abstract

In the present PhD Thesis, the development of polymeric nanoparticles encapsulated with myelin peptide analogues involved in the emerge and progress of multiple sclerosis (MS) took place, along with their biological evaluation. More specific, particles of poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA loaded with peptides based on mouse/rat (rMOG) epitope 35-55 of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) conjugated or not with saccharide residues were developed. Conjugation of peptide analogues with saccharides such as mannose and glucosamine aimed at the possible interaction to mannose receptors (MR) located in surface of the dendritic cells (DCs), major antigen presenting cells involved in MS. These saccharides show great binding affinity with MR and such interaction of the molecules with the receptors could lead on tolerance against the disease. In this thesis, the design and development of PLGA nanoparticles with encapsulated peptide analogues, providing increased stability and a slow controlled release from the polymeric matrix, were studied according to their physicochemical properties for the improvement and optimization of synthesis methodology. In addition, a study of slow release and quantification on both initially encapsulated peptide and daily release in saline in vitro was performed. Finally, the synthesized nanoparticles were biologically evaluated in vivo using the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), animal model of MS. For these experiments both prophylactic and therapeutic immunization were performed in young female mice C57Bl/6. Tissues obtained from the mice were examined for infiltrations and destruction of white matter due to the disease, while the levels of cytokines found in blood serum at different stages of the disease were also studied.

Το αντικείμενο της παρούσας ΔΔ ήταν η ανάπτυξη πολυμερικών νανοσωματιδίων με εγκλωβισμένα πεπτιδικά ανάλογα που εμπλέκονται στην εμφάνιση και εξέλιξη της σκλήρυνσης κατά πλάκας (ΣΚΠ, Multiple Sclerosis, MS), καθώς και η βιολογική αξιολόγηση αυτών. Συγκεκριμένα, αναπτύχθηκαν σωματίδια πολυ(γλυκολικού-γαλακτικού) οξέος [poly(lactic-co-glycolic) acid, PLGA] με εγκλωβισμένα πεπτίδια με βάση τον επίτοπο 35-55 της μυελικής γλυκοπρωτεΐνης των ολιγοδενδριτών (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, ΜΟG) με βάση την αλληλουχία που συναντάται στους μύες (rMOG), συζευγμένα ή μη με μόρια σακχαριτών. Η σύζευξη των πεπτιδικών αναλόγων με μόρια σακχαριτών όπως η μαννόζη και η γλυκοζαμίνη στόχευσε στην πιθανή αλληλεπίδραση με τους υποδοχείς μαννόζης που βρίσκονται στα δενδριτικά κύτταρα, κύρια αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα που εμπλέκονται στην ΣΚΠ, με τους οποίους υποδοχείς παρουσιάζουν ισχυρή προσδετική ικανότητα και με σκοπό την ανάπτυξη ανοσοανοχής απέναντι στην νόσο.Η διατριβή περιλαμβάνει τον σχεδιασμό και την ανάπτυξη PLGA νανοσωματιδίων που θα φέρουν εγκλωβισμένα τα πεπτιδικά ανάλογα, παρέχοντας αυξημένη σταθερότητα στα πεπτιδικά ανάλογα και παρέχοντας την δυνατότητα βραδείας αποδέσμευσης από την πολυμερική μήτρα. Τα νανοσωματίδια που αναπτύχθηκαν μελετήθηκαν ως προς τα φυσικοχημικά τους χαρακτηριστικά ώστε να βελτιστοποιηθεί η μεθοδολογία σύνθεσης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη της βραδείας αποδέσμευσης και ποσοτικός προσδιορισμός τόσο της αρχικά εγκλωβισμένης ουσίας όσο και της ημερήσιας αποδέσμευσης σε φυσιολογικό ορό in vitro. Τέλος, τα συντεθειμένα νανοσωματίδια αξιολογήθηκαν βιολογικά in vivo στο πειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ, την πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE) με χρήση δύο μοντέλων ανοσοποίησης, προφυλακτικού και θεραπευτικού σε θηλυκούς μύες του γένους C57BL/6. Οι ιστοί που ελήφθησαν από τους μύες μελετήθηκαν για διηθήσεις και καταστροφές της λευκής ουσίας που οφείλονται στην ασθένεια ενώ μελετήθηκαν και τα επίπεδα κυτταροκινών στον ορό αίματος στα διάφορα στάδια εξέλιξης της νόσου.