Electrochemical study of redox enzymes and their utilization on modified electrodes

Abstract

The present work focuses on the extraction of thermodynamic and kinetic information of redox enzymes and molecules they interact with, through electrochemical techniques. In the introduction, a quick overview is made on redox enzymes in general and how they can be exploited electrochemically together with the challenges faced. As one of the most prominent problems when using cyclic voltammetry for the study of redox enzymes is the existence capacitance currents, a major part of this work focuses on exploring an alternative, large amplitude fast Fourier transform alternating current voltammetry (FTacV), so as to overcome this obstacle. The investigation of FTacV takes place for both free in a solution and immobilized on an electrode surface electroactive species. The respective results for cyclic voltammetry are presented as well for comparison. Starting with the free species, the chief observables, i.e. peak height, peak widt hand peak potential of the principal peaks, are determined for FTacV for a reversible reaction of free electroactive species. The values of the chief observables are derived from a semi-analytic solution as well as from the solution of the full initial-boundary value problem. A condition under which FTacV is independent of scan rate, up to the fifth harmonic, is introduced. The dependence of the chief observables on the parameters of the system is shown. Then, the case of quasi reversible and irreversible kinetics is studied correlating the chief observables with the electrode kinetics. Moreover two step electron reactions are examined in order to get a visual representation of the resulting voltammograms. Two mechanisms are also explored when coupling an electroactive species with a homogeneous reaction. The first is the EC mechanism and the second the homogeneous catalytic reaction scheme. Convolution voltammetry is also introduced in this work as some of its aspects would of use in the experimental part of this work. The analysis that comes right after that concerns the immobilized species. Starting from an one step reaction of an electroactive spece is doing a similar study to the one conducted for the free species, moving on to two step reactions. As a next step,the coupling of the redox reaction of the immobilized species with a reaction that concerns a species free in the bulk solution shall follow. More specifically the Michaelis-Menten kinetics of an immobilized enzyme shall be thoroughly analyzed as the case of an electrochemical-chemical (EC) mechanism. Methodologies regarding the extraction of kinetic constants are also introduced. Moving on to the experimental section of this work, Lytic polysaccharide monooxy-genases (LPMOs) are introduced and the expression process of three LPMOs with two different expression vectors is analyzed. These expressed LPMOs are then immobilized with two different methodologies and kinetic information is obtained regarding both the interaction of the immobilized enzyme with the electrode and the interaction of the enzyme with phosphoric acid swollen cellulose (PASC) using FTacV. The methodologies that are introduced earlier are utilized in this case. The next step is to examine possible electron donors that work with the LPMOs electrochemically using cyclic voltammetry, FTacV and convolution voltammetry. Various phenolic compounds and ling in from wheat straw are first examined as electrondonors with an LPMO analyzing their reaction products with high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Then,based on the elution patterns and the presence and intensity of the oxidized products, incombination with the voltammetric data, an interpretation was given to the interaction of these substrates as reducing agents for the LPMOs. In the last part of the work, a laccase like multi copper oxidase from the fungus Thermothelomyces Thermophila is examined immoblized on an electrode surface and its interaction with epinephrine using FTacV. The application of the theory of probingan immobilized redox enzyme reacting with a free in the solution substrate following aMichaelis-Menten kinetic scheme is thoroughly examined.

Η παρούσα εργασία εστιάζει στην εξαγωγή θερμοδυναμικών και κινητικών δεδομένων οξειδοαναγωγικών ενζύμων καθώς και μορίων που αντιδρούν με αυτά, μέσω ηλεκτροχημικών τεχνικών. Στην εισαγωγή της εργασίας αυτής, πραγματοποιείται μία γενική επισκόπηση για τα οξειδοαναγωγικά ένζυμα και του πως μπορούν να αξιοποιηθούν ηλεκτροχημικά, καθώς και των δυσκολιών που εμφανίζονται. Καθώς ένα από τα κύρια προβλήματα όταν χρησιποιείται η κυκλική βολταμμετρία για την μελέτη οξειδοαναγωγικών ενζύμων είναι τα ρεύματα λόγω χωρητικότητας, ένα μεγάλο μέρος της δουλειάς αυτής επικεντρώνεται στην διερεύνηση της χρήσης της κυκλικής βολταμμετρίας εναλασσόμενου ρεύματος διαταραχής μεγάλου πλάτους με μετασχηματισμό Φουριέ, (large amplitude fast Fourier transform alternating current voltammetry -FTacV), ως εναλλακτική για την άρση του προαναφερθέντος εμποδίου. Η διερεύνησητης FTacV γίνεται και για ελεύθερα στο διάλυμα και για ακινητοποιημένα σε ηλεκτροδιακή επιφάνεια, ηλεκτροενεργά είδη. Παρατίθενται και τα αντίστοιχα αποτελέσματα για την κυκλική βολταμμετρία για σύγκριση. Ξεκινώντας από το ελεύθερο είδος, τα κυρίως παρατηρούμενα μεγέθη, δηλαδή το ύψος,το πλάτος και το δυναμικό των κορυφών, προσδιορίζονται για ελεύθερα στο διάλυμα ηλεκτροενεργά είδη όταν χρησιμοποιείται η FTacV. Οι τιμές των κυρίως παρατηρούμενων μεγεθών προσδιορίζονται από μία ημιαναλυική λύση καθώς και από την ολοκληρωμένη λύση του προβλήματος αρχικών-συνοριακών τιμών. Είσαγεται επίσης μία συνθήκη κατάτης οποία η FTacV καθίσταται ανεξάρτητη της ταχύτητας σάρωσης και εξάγονται οι εξαρτήσεις των κυρίως παρατηρούμενων μεγεθών από το πλάτος της διαταραχής. Κατόπιν εξετάζεται η περίπτωση ημιαντιστρεπτών και αναντίστρεπτων κινητικών, συσχετίζοντας τα κυρίως παρατηρούμενα μεγέθη με την ηλεκτροχημική κινητική. Επίσης, μελετώνται δράσεις δύο σταδίων και γίνεται γραφική αναπαράσταση των βολταμμογραφημάτων που προκύπτουν. Ακόμα δύο μηχανισμοί εξερευνώνται κατά την σύζευξη ενός ηλεκτροχημικού είδους με μία ομογενή χημική δράση. Πραγματοποιείται ακόμα μία εισαγωγή στην βολταμμετρία συνέλιξης, η οποιά θα χρησιμοποιηθεί σε κομμάτι της ανάλυσης πειραματικών αποτελεσμάτων. Η αμέσως επόμενη ανάλυση αφορά σε ακινητοποιημένα είδη. Η ανάλυση ξεκινάει από δράσεις ενός σταδίου για ακινητοποιημένα ηλεκτροενεργά είδη, κάνοντας παρόμοια ανάλυση με αυτήν για το ελεύθερο είδος, φτάνοντας σε δράσεις δύο σταδίων. Σε επόμενη φάση μελετάται η σύζευξη της οξειδοαναγωγικής δράσης ακινητοποιημένου είδους με μία δράση που αφορά σε χημικό είδος που βρίσκεται ελεύθερο στον κύριο όγκο του διαλύματος. Ειδικότερα, οι κινητικές που αναλύονται είναι η κινητική Michaelis-Menten και το σενάριο όπου μία χημική αντίδραση έπεται της ηλεκτροχημικής (μηχανισμός EC). Αναλύονται οι αντίστοιχες μεθοδολογίες που αφορούν στην εξαγωγή κινητικών σταθερών. Συνεχίζοντας στο πειραματικό κομμάτι της εργασίας, εισάγονται οι βασικές έννοιες γύρω από τις λυτικές μονοξυγενάσες των πολυσακχαριτών (Lytic polysaccharide monooxy-genases - LPMOs) και αναλύεται η διαδιακασία ετερόλογης έκφρασης τριών τέτοιων ενζύμων σε δύο διαφορετια συστήματα. Τα εκφρασμένα ένζυμα κατόπιν ακινητοποιούνται με δύο διαφορετικές μεθοδολογίες και εξάγονται κινητικές πληροφορίες σχετικά με την αλληλεπίδραση τόσο της δράσης του ακινητοποιημενου ενζύμου με το ηλεκτρόδιο καθώς και με διογκωμένη με φωσφορικό οξύ κυτταρίνης (phosphoric acid swollen cellulose - PASC). Η χρησιμοποιούμενη τεχνική για αυτήν την μελέτη είναι η FTacV. Οι μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται είναι αυτές που έχουν ήδη παρουσιαστεί. Το επόμενο βήμα είναι η ηλεκτροχημική μελέτη πιθανών δοτών ηλεκτρονίων για τις LPMO με τη χρήση κυκλικής βολταμμετρίας, βολταμμετρίας συνέλιξης και FTacV. Διαφορετικές φαινολικές ουσίες και λιγνίνη από άχυρο εξετάζονται ως προς την αποτελεσματικότητά τους ως δότες ηλεκτρονιών χρησιμποιώντας χρωματογραφία ιοντοεναλλαγής υψηλής απόδοσης συζευγμένη με παλμικό αμπερομετρικό ανιχνευτή (high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection, HPAEC-PAD). Κατόπιν, βασιζόμενοι στα οξειδωμένα προϊόντα και την ένταση των κορυφών των χρωματογραφημάτων, σε συνδυασμό με βολταμμετρικά δεδομένα, δίνεται ερμηνεία για την αλληλεπίδραση των εξεταζόμενων ουσιών ως δότες ηλεκτρονίων και τις LPMOs. Στο τελευταίο κομμάτι αυτής της δουλειάς το ένζυμο που αναλύεται είναι μία οξειδάση πολλαπλών χαλκών με ενεργότητα λακάσης από το μύκητα Thermothelomyces Thermophila ενώ είναι ακινητοποιημένο στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου και αλληλεπιδρά με επινεφρίνη. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιείται η FTacV. Γίνεται η εφαρμογή της θεωρίας της μελέτης ενός ακινητοποιημένμου οξειδοαναγωγικού ενζύμου που αντιδρά με ένα είδος ελεύθερο στο διάλυμα και ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten.