Σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 και ρινική φορεία σε Staphylococcus aureus: γονιδιακοί πολυμορφισμοί και διαμεσολαβητές της μη ειδικής ανοσολογικής απάντησης

Abstract

Objectives: Staphylococcus aureus nasal carriage, an important risk factor for severe infections, is common in patients with type 2 diabetes mellitus (T2D), possibly due to dysregulation of innate immunity. Genetic polymorphisms in host innate immune genes, including interleukin 6 (IL6) and vitamin D receptor (VDR) genes, have been found to be associated with susceptibility to several diseases, including type 2 diabetes (T2D) and various infections. Additionally, vitamin D and cathelicidin (LL-37), a downstream target of vitamin D - VDR complex, are both innate immune markers that play a key role in immunomodulation and may contribute to host defence mechanisms against S. aureus. The aim of this study was to investigate the role of rs1800795 IL6 single nucleotide polymorphism (SNP) on the susceptibility to T2D, as well as to nasal carriage of S. aureus among individuals with T2D. We also examined whether LL-37 serum levels are influenced by the four most common VDR gene polymorphisms [FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232), and TaqI (rs731236)] in individuals with T2D. Furthermore, we tried to determine the impact of 25-hydroxy vitamin D [25(OH)D] and LL-37 on S. aureus nasal carriage status in T2D patients. Finally, this study aimed to assess the contribution of S. aureus nasal colonization on subsequent staphylococcal infections in diabetic subjects. Patients & methods: The study group consisted of a cohort of 240 T2D patients, followed up at the outpatient clinic of Internal Medicine and Endocrinology Department of University Hospital of Heraklion, during 2013-2014. The control group consisted of 236 healthy age- and sex-matched subjects. All individuals were of self-reported Cretan origin. From all T2D patients, nasal swab was obtained to determine S. aureus nasal colonization by rotating a sterile fiber-tipped swab four times in both anterior nares of each enrolled individual. A repeat swab was obtained, at a one-month interval, for the estimation of persistent carriage status. Diabetic participants were asked about the use of vitamin D supplements. Whole blood was collected from all participants enrolled in the study. One hundred and forty-four patients with T2D and one hundred and eighty healthy controls were genotyped for the IL6 rs1800795 SNP by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) and TaqI (rs731236) VDR gene polymorphisms had previously been investigated in 173 T2D patients by PCR-RFLP. Serum levels of 25(OH)D were estimated in 118 diabetic patients and 94 controls using chemiluminescence immunoassay (CLIA), while serum levels of LL-37 were evaluated in 118 diabetic patients using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). All T2D patients were followed up for 6 years (2014-2020) and any cases of staphylococcal infections were recorded during this period. Results: S. aureus nasal colonization was found to be at a percentage of 25.8% of T2D patients. Among them, 9.6% were defined as persistent carriers. The G/C genotype and the minor allele C of IL6 rs1800795 SNP analyzed were more common in individuals with T2D than in healthy controls (p=0.004, OR=1.98, 95% CI 1.24-3.18 and p=0.011, OR=1.59, 95% CI 1.11-2.26, respectively). No statistically significant differences have been found between carriers and non-carriers in terms of either allele or genotype frequency. Analyses of subgroups, based on the pattern of carriage (intermittent or permanent), also did not reveal significant differences. T2D patients presented significantly lower 25(OH)D serum levels compared to controls (p<0.001). In particular, 88.6% of T2D patients, whereas only 59.6% of controls, in our study, presented vitamin D deficiency (<20ng/ml) or insufficiency (21-29ng/ml). No effect of vitamin D daily administration has been found on the rates of S. aureus nasal carriage in T2D patients (p=0.706). T2D patients presented remarkably low serum LL-37 levels (median 0.89, range 0.05-8.62 ng/ml). The presence of the BsmI b allele was related to higher levels of LL-37 (p=0.05), as well as BsmI bb genotype showed higher LL-37 concentratons compared to Bb genotype (p=0.035). TaqI TT homozygotes presented higher LL-37 levels compared to TaqI Tt heterozygotes (p=0.003), as well as the presence of the TaqI T allele was related to a trend of increased levels of LL-37, though not statistically significant (p=0.07). Circulating levels of LL-37 were higher in nasal carriers compared to non-carriers (p<0.001), whereas no difference was observed in 25(OH)D levels. A strong positive correlation was observed between 25(OH)D and LL-37 among non-carriers (r=0.48, p<0.001). This relationship was independent of vitamin D supplementation in a linear regression analysis (p=0.002). Finally, assessing the development of clinical staphylococcal infections in T2D patients during the 6-year follow-up, we found no episodes of bacteremia, while very few episodes of skin and soft tissue infections, caused by S. aureus, were reported. Conclusions: Our study showed that T2D patients present low serum concentrations of vitamin D and LL-37, suggesting defects in innate immunity, which could contribute to higher rates of S. aureus nasal colonization. No impact of vitamin D supplementation on S. aureus nasal colonization has been found in T2D patients. Another finding is that IL6 rs1800795 SNP, although is associated with increased risk for T2D development, might not be associated with higher prevalence of S. aureus nasal carriage in patients with T2D. Our findings, also, suggest that TaqI and BsmI VDR gene polymorphisms are related to serum levels of LL-37, which could be a primary determinant for different S. aureus carriage states in T2D. Finally, we did not prove any significant difference in the frequency of the infections we investigated between S. aureus colonized and non-colonized patients. A weakness of the study is the relatively small number of samples and, therefore, our results need to be confirmed in larger studies.

Εισαγωγή: Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 (ΣΔ2) χαρακτηρίζεται από δυσλειτουργία της μη ειδικής ανοσολογικής απάντησης, οδηγώντας σε υψηλά ποσοστά αποικισμού από Staphylococcus aureus. Η ρινική φορεία σε S. aureus, που αποτελεί τη συχνότερη θέση αποικισμού, φαίνεται πως αυξάνει τον κίνδυνο για διεισδυτικές σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις με υψηλή νοσηρότητα και θνητότητα. Γενετικοί πολυμορφισμοί γονιδίων διαμεσολαβητών της μη ειδικής ανοσιακής απάντησης, όπως του γονιδίου της ιντερλευκίνης-6 (IL6) και του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR) έχουν συσχετιστεί με ευπάθεια στο ΣΔ2 και σε λοιμώξεις. Επιπρόσθετα, η βιταμίνη D εμφανίζει σημαντικές ανοσοτροποποιητικές δράσεις και ειδικότερα, μέσω της αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα της, επάγει την έκφραση της καθελισιδίνης (LL-37), ενός ενδογενούς αντιμικροβιακού πεπτιδίου που συμμετέχει στην άμυνα του ξενιστή ενάντια στο χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο. Στην παρούσα μελέτη ερευνήθηκε ο ρόλος του μονονουκλεοτιδικού πολυμορφισμού (SNP) rs1800795 της IL6 τόσο στον κίνδυνο εμφάνισης ΣΔ2, όσο και στη ρινική φορεία με S. aureus σε ασθενείς με ΣΔ2. Ακολούθως εξετάσθηκε η επίδραση των τεσσάρων SNPs του γονιδίου του VDR FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) και TaqI (rs731236) στα επίπεδα ορού της LL-37. Επιπρόσθετα μελετήθηκε η συσχέτιση των συγκεντρώσεων ορού της 25-υδρόξυ βιταμίνης D [25(ΟΗ)D], που αποτελεί τον πλέον αξιόπιστο δείκτη της βιταμίνης D, και της LL-37 με τα πρότυπα ρινικής φορείας σε S. aureus (εμμένουσα, διαλείπουσα, μη-φορεία) στους ΣΔ2 ασθενείς. Τέλος, ερευνήθηκε εάν η ρινική φορεία σε S. aureus αποτελεί παράγοντα κινδύνου για διεισδυτικές σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις στους διαβητικούς ασθενείς. Ασθενείς & μέθοδοι: Η ομάδα μελέτης αποτελούνταν από 240 ασθενείς με ΣΔ2 που παρακολουθούνταν στα εξωτερικά ιατρεία της Παθολογικής και της Ενδοκρινολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου κατά τη χρονική διάρκεια 2013 - 2014. Η ομάδα ελέγχου απαρτιζόταν από 236 μη-διαβητικούς μάρτυρες. Όλοι οι συμμετέχοντες στη μελέτη ήταν Κρητικής καταγωγής. Δείγμα για καλλιέργεια ρινικού επιχρίσματος ελήφθη από όλους τους ασθενείς με ΣΔ2 με την περιστροφή του κατάλληλου στυλεού τέσσερις φορές και στους δυο ρινικούς ρώθωνες του κάθε συμμετέχοντος. Επαναληπτικό δείγμα ελήφθη μετά από διάστημα μιας εβδομάδας έως ένα μήνα για την ταξινόμηση των ασθενών σε εμμένοντες, διαλείποντες φορείς και μη-φορείς. Επιπρόσθετα κατεγράφησαν όσοι ΣΔ2 ασθενείς ελάμβαναν συμπληρώματα βιταμίνης D καθημερινά. Από τους συμμετέχοντες ελήφθη δείγμα αίματος για γονοτύπηση και για τον ποσοτικό προσδιορισμό της 25(ΟΗ)D και της LL-37. Σε 144 ασθενείς με ΣΔ2 και στους 180 μη-διαβητικούς μάρτυρες έγινε γονοτύπηση του rs1800795 SNP της IL6 μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και ανάλυσης πολυμορφισμού μήκους θραύσματος περιορισμού (PCR-RFLP). Σε 173 ΣΔ2 ασθενείς είχε προηγηθεί γονοτύπηση των FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) και TaqI (rs731236) πολυμορφισμών του γονιδίου VDR μέσω PCR-RFLP. Τα επίπεδα ορού της 25(ΟΗ)D μετρήθηκαν με την ανοσολογική μέθοδο της χημειοφωταύγειας σε 118 διαβητικούς ασθενείς και σε 94 μάρτυρες, ενώ και τα επίπεδα της LL-37 εκτιμήθηκαν με τη δοκιμασία της ενζυμοσυζευγμένης ανοσοπροσρόφησης σε 118 διαβητικούς ασθενείς. Όλοι οι ασθενείς με ΣΔ2 παρακολουθήθηκαν για 6 έτη (2014-2020) και καταγράφηκαν επεισόδια λοιμώξεων από S. aureus στο χρονικό αυτό διάστημα. Αποτελέσματα: Η ρινική φορεία με S. aureus βρέθηκε σε ποσοστό 25.8% των ασθενών με ΣΔ2, ενώ η εμμένουσα στο 9.6%. Ο G/C γονότυπος, καθώς και το αλλήλιο C του SNP rs1800795 του γονιδίου της IL6 βρέθηκαν με μεγαλύτερη συχνότητα σε ασθενείς με ΣΔ2 σε σχέση με τους μάρτυρες (p=0.004, OR=1.98, 95% CI 1.24-3.18 και p=0.011, OR=1.59, 95% CI 1.11-2.26, αντιστοίχως). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στη συχνότητα αλληλίου ή γονοτύπου μεταξύ φορέων και μη-φορέων ασθενών με ΣΔ2. Η ανάλυση υποομάδων ασθενών με ΣΔ2, βασισμένη στο μοτίβο φορείας (εμμένουσα ή διαλείπουσα) επίσης δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντικές διαφορές. Οι ασθενείς με ΣΔ2 παρουσίαζαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές ορού 25(OH)D σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0.001). Συγκεκριμένα, το 88.6% των διαβητικών ασθενών, ενώ μόλις το 59.6% των μη-διαβητικών μαρτύρων παρουσίαζε ανεπάρκεια (21-29ng/ml) ή έλλειψη (<20ng/ml) της βιταμίνης D. Η χορήγηση βιταμίνης D δεν επηρέασε τα ποσοστά ρινικής φορείας στους ΣΔ2 ασθενείς (p=0.706). Εξαιρετικά χαμηλά ήταν τα επίπεδα ορού της LL-37 που ανευρέθησαν στο σύνολο των διαβητικών ασθενών (διάμεση τιμή 0.89, εύρος 0.05-8.62 ng/ml). Η παρουσία του BsmI b αλληλίου του γονιδίου VDR συσχετίστηκε με μεγαλύτερη συγκέντρωση LL-37 (p=0.05), ενώ ο BsmI bb γονότυπος συσχετίστηκε με υψηλότερα επίπεδα LL-37 συγκριτικά με τον Βb γονότυπο (p=0.035). Οι ΤaqI TT ομοζυγώτες παρουσίαζαν υψηλότερες συγκεντρώσεις LL-37 σε σχέση με τους ΤaqI Tt ετεροζυγώτες (p=0.003), ενώ το Τ αλλήλιο παρουσίαζε τάση υψηλότερων επιπέδων ορού LL-37, ωστόσο μη στατιστικά σημαντική (p=0.07). Οι διαβητικοί ασθενείς με ρινική φορεία σε S. aureus παρουσίαζαν υψηλότερες συγκεντρώσεις LL-37 συγκριτικά με τους μη-φορείς διαβητικούς ασθενείς (p<0.001), ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς την 25(OH)D μεταξύ των δύο ομάδων. Ισχυρά θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ανάμεσα στην 25(OH)D και την LL-37 στους μη-φορείς (r=0.48, p<0.001), η οποία ήταν ανεξάρτητη από τη χορήγηση συμπληρωμάτων βιταμίνης D με βάση την ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης (p=0.002). Κατά την 6ετή παρακολούθηση των διαβητικών ασθενών δε διαπιστώθηκαν επεισόδια βακτηριαιμίας, ενώ ελάχιστα ήταν τα επεισόδια λοιμώξεων δέρματος και μαλακών μορίων οφειλόμενα σε S. aureus. Συμπεράσματα: Τα ευρήματα της μελέτης δείχνουν ότι ο ρινικός αποικισμός από S. aureus είναι συχνός στους ασθενείς με ΣΔ2, που θα μπορούσε να οφείλεται σε διαταραχή της μη ειδικής ανοσολογικής απάντησης, όπως αναδεικνύεται από τα μειωμένα επίπεδα της 25(OH)D και του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37 στο αίμα. Η χορήγηση συμπληρωμάτων βιταμίνης D δε φαίνεται να επιδρά στα ποσοστά ρινικής φορείας σε S. aureus στους ΣΔ2 ασθενείς Ο πολυμορφισμός rs1800795 της IL6 σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΣΔ2 αλλά όχι με αυξημένη επίπτωση ρινικής φορείας S. aureus σε αυτούς τους ασθενείς. Οι πολυμορφισμοί TaqI και BsmI του VDR φαίνεται πως επιδρούν στις συγκεντρώσεις ορού της LL-37, οι οποίες ενδεχομένως συμμετέχουν καθοριστικά στο πρότυπο ρινικής φορείας στο χρυσίζοντα σταφυλόκοκκο στους διαβητικούς ασθενείς. Η κατάσταση ρινικής φορείας σε S. aureus δεν αποτέλεσε παράγοντα κινδύνου για βακτηριαιμία ή άλλες διεισδυτικές σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις. Αυτά τα αποτελέσματα βασίζονται σε ένα σχετικά μικρό πληθυσμό και πρέπει να επιβεβαιωθούν σε μεγαλύτερες ομάδες ασθενών.