Χαρακτηρισμός νανοσωματιδίων προερχομένων από διεργασίες καύσης και συνθετικών νανοσωματιδίων και αξιολόγηση επιπτώσεων τεχνολογιών ελέγχου

Abstract

Increased concerns have been raised the last decade on the potential of Nanoparticles (NPs) aerosols (combustion generated and/or engineered) to cause an adverse impact on humans health, affecting primarily the respiratory system, and the environment. This thesis will mainly focus on the research of combustion-generated NPs aerosols, without neglecting to incorporate a case study of Engineered Nanoparticles (ENPs) related to the emission control technologies of combustion engines. The physicochemical characteristics/properties of NPs aerosols (particle number and size, size distribution, chemical composition and surface area) have been analysed and measured with the aim to demonstrate the importance of understanding and assessment of the possible toxicity of nanomaterials. The standard characterisation techniques are presented together with innovative technologies developed based on the photoelectric effect and applied for the detection and/or classification of Polyaromatic Hydrocarbons (PAHs) adsorbed on combustion-generated particles surface from vehicle exhaust For the evaluation of the effect of the particle size distribution - one of the very pertinent factors influencing the toxic effect of exhaust emissions- a Selective Particle Size (SPS) sampler able to provide continuous delivery of soot particles of specific size ranges, has been designed, constructed and evaluated. The design of the sampler combines principles of aerosol transport phenomena and separation technologies. Particles smaller than a given size are removed from the exhaust by diffusional deposition, while removal of particles above a given size is achieved by low-pressure inertial impaction. By applying the SPS sampler to diesel exhaust, it is demonstrated that it is possible to obtain two aerosol streams with widely separated particle size distributions (of nanometric dimensions), suitable for biological exposure studies. In order to study the various health influencing parameters related to NPs aerosols, there is an urgent need for appropriate sampling devices and methods for cell exposure studies that simulate the respiratory system and facilitate the associated biological and toxicological tests. In this thesis, a specific novel concept for an in vitro air-liquid interface (ALI) cell culture exposure chamber was introduced to allow the uniform exposure of cell cultures to NPs aerosols. Furthermore, an advanced Multiculture Exposure Chamber (MEC II) was designed, constructed and evaluated. It was validated with two types of nanoparticles (Diesel engine soot aggregates and engineered nanoparticles used in different emission control technologies) and with state-of-the-art nanoparticle measurement instrumentation, to assess the local deposition of nanoparticles on the cell cultures. Also, the dose of nanoparticles to which cell cultures are being exposed was evaluated based on measurements of the size-specific nanoparticle collection efficiency. Also, the potential of the nanoparticles aerosols to increase the interleukins production and generate reactive oxygen species (ROS) (e.g. free radicals and peroxides generation) was monitored and thus expressing the oxidative stress of the cells which can cause extensive cellular damage or damage on DNA. Moreover, the production of ROS/oxidative stress in cells from CeO2 particles was analysed via the correlation of size and structural characteristics (crystallite size, specific surface area and porosity) to the ability to oxidise soot and generate ROS/oxidative stress in cells. Testing and evaluation of the exposure chamber were performed by exposing different cell line cultures either to engine exhaust aerosol or to metal oxide (CeO2) nanoparticles. Exposures of alveolar epithelial cells and blood cells to exhaust aerosol NPs were performed to determine whether the Diesel emission control technologies (Diesel Oxidation Catalyst (DOC) in series with a Diesel Particulate Filter (DPF) or the addition of CeO2 fuel additive to the Diesel fuel) affect the immunomodulatory responses of cells. Finally, in order to evaluate the effect of the exhaust particle size distribution in biological responses (cytokine promoter activity, cytokine secretion and cell viability of human cells) experiments applying the SPS in series with the exposure chamber, were undertaken.

Ιδιαίτερη ανησυχία παρατηρείται κατά την τελευταία δεκαετία στην επιστημονική κοινότητα, σχετικά με τις δυσμενείς επιπτώσεις στην υγεία - κυρίως στο αναπνευστικό σύστημα- και στο περιβάλλον, των αερολυμάτων αποτελούμενων από νανοσωματίδια που προέρχονται είτε από διεργασίες καύσης (κυρίως ρύπανση από οχήματα) είτε παράγονται μέσω σύνθεσης για προϊόντα νανοτεχνολογίας. Η διατριβή επικεντρώνεται κυρίως στην έρευνα αερολυμάτων νανοσωμαιδίων που παράγονται από διεργασίες καύσης, χωρίς να παραλείψει να ενσωματώσει τη μελέτη συνθετικών νανοσωματιδίων που σχετίζονται με τις τεχνολογίες ελέγχου εκπομπών κινητήρων καύσης. Τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά/ιδιότητες των αερολυμάτων νανοσωματιδίων (αριθμός σωματιδίων και μέγεθος, κατανομή μεγέθους, χημική σύσταση και ειδική επιφάνεια) αναλύθηκαν και μετρήθηκαν με σκοπό την κατανόηση και αξιολόγηση της συσχέτισης τους με πιθανή τοξικότητα των σωματιδίων. Οι κύριες τεχνικές χαρακτηρισμού παρουσιάζονται μαζί με ορισμένες καινοτόμες τεχνολογίες που έχουν αναπτυχθεί με βάση τη θεωρία του φωτοιονισμού και εφαρμόζονται για την ανίχνευση ή/και ταξινόμηση των σωματιδίων που παράγονται από την καύση σε κινητήρες οχημάτων (σωματίδια αιθάλης) αλλά και συμπυκνωμάτων προερχόμενων από πυρήνωση/συμπύκνωση συστατικών των καυσαερίων (πολυαρωματικοί υδρογονάνθρακες, PAH) που έχουν προσροφηθεί στην επιφάνειά των σωματιδίων. Για την αξιολόγηση της επίδρασης της κατανομής μεγέθους σωματιδίων στην υγεία αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε πρωτότυπος δειγματολήπτης επιλεκτικού διαχωρισμού μεγέθους σωματιδίων, (Selective Particle Size, SPS sampler), ικανός να παρέχει συνεχή ροή νανοσωματιδίων συγκεκριμένων περιοχών μεγέθους. Ο σχεδιασμός του SPS βασίζεται και συνδυάζει τις αρχές των φαινομένων μεταφοράς αερολύματος και των τεχνολογιών διαχωρισμού. Σωματίδια μικρότερα από ένα δεδομένο μέγεθος απομακρύνονται από την εξάτμιση λόγω της διάχυσης Brown, ενώ η αφαίρεση σωματιδίων πάνω από ένα δεδομένο μέγεθος επιτυγχάνεται με το μηχανισμό της αδρανειακής μεταφοράς/πρόσκρουσης. Εφαρμόζοντας το δείγματολήπτη SPS στα καυσαέρια από κινητήρες οχημάτων, αποδεικνύεται ότι είναι δυνατόν να ληφθούν δύο ρεύματα αερολύματος με ευρέως διαχωρισμένες κατανομές μεγέθους σωματιδίων (νανομετρικών διαστάσεων), κατάλληλες για μελέτες βιολογικής έκθεσης. Προκειμένου να μελετηθούν οι διάφορες παράμετροι που επηρεάζουν την υγεία του ανθρώπου και σχετίζονται με τα αερολύματα νανοσωματιδίων, υπάρχει απαίτηση για την εύρεση μεθόδων/εργαλείων για οργανοτυπική έκθεση και ομοιόμορφη έκθεση κυττάρων σε νανοσωματίδια. Οργανοτυπική έκθεση σημαίνει ότι τα νανοσωματίδια πρέπει να έρθουν σε επαφή με το βιολογικό δείγμα με όσο πιο παρόμοιο τρόπο γίνεται με αυτόν της πραγματικής έκθεσης κατά την εισπνοή, ενώ το βιολογικό δείγμα πρέπει να διατηρείται σε αντίστοιχες οργανοτυπικές συνθήκες (θερμοκρασία, υγρασία, κλπ). Για το σκοπό αυτό, στην παρούσα διατριβή, σχεδιάστηκαν, κατασκευάστηκαν και αξιολογήθηκαν καινοτόμοι θάλαμοι ομοιόμορφης και οργανοτυπικής in vitro έκθεσης πολλαπλών βιολογικών δειγμάτων (Multiculture Exposure Chamber, MEC), όπου οι καλλιέργειες γίνονται στη διεπιφάνεια υγρού/αερίου σε ειδικά ενθέματα (inserts) που τοποθετούνται στις θέσεις των φρεατίων (wells) των πιάτων καλλιεργειών. Η πρώτη γενιά του θαλάμου έκθεσης περιλάμβανε 4 πιάτα καλλιεργειών με 6 διαθέσιμα φρεάτια για κυτταρικές καλλιέργειες (σύνολο 24 θέσεις καλλιεργειών), ενώ η δεύτερη γενιά του θαλάμου MEC ΙΙ αύξησε τον αριθμό των καλλιεργειών σε 36. Η αξιολόγησή της ομοιόμορφης εναπόθεσης των νανοσωματιδίων στις κυτταρικές καλλιέργειες πραγματοποιήθηκε με δύο τύπους νανοσωματιδίων (σωματίδια αιθάλης κινητήρα ντίζελ, και συνθετικά νανοσωματίδια που ενσωματώνονται σε τεχνολογίες ελέγχου απαερίων εξάτμισης κινητήρα) και με όργανα μέτρησης των χαρακτηριστικών των νανοσωματιδίων. Επίσης, η ομοιόμορφη και ελεγχόμενη δοσιμετρία των νανοσωματιδίων, στα οποία εκτίθενται οι κυτταρικές καλλιέργειες, αξιολογήθηκε με βάση μετρήσεις της απόδοσης συλλογής νανοσωματιδίων και μικροσκοπία ηλεκτρονικής διέλευσης (TEM). Επιπλέον, εξετάστηκε η πιθανότητα παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) (π.χ. παραγωγή ελεύθερων ριζών και υπεροξειδίων) με αποτέλεσμα την παραγωγή οξειδωτικού στρες στα κύτταρα, που μπορεί να προκαλέσει εκτεταμένη κυτταρική βλάβη ή βλάβη στο DNA. Επιπλέον, μετρήθηκε η παραγωγή ROS/οξειδωτικού στρες σε κύτταρα από σωματίδια CeO2 με σκοπό τη συσχέτιση του μεγέθους και των δομικών χαρακτηριστικών τους (κρυσταλλικό μέγεθος, ειδική επιφάνεια και πορώδες) με την ικανότητα οξειδώσεως αιθάλης και τη δημιουργία ROS/οξειδωτικού στρες στα κύτταρα. Ο έλεγχος και η αξιολόγηση και των δύο θαλάμων έκθεσης πραγματοποιήθηκε εκθέτοντας διαφορετικές κυτταρικές καλλιέργειες είτε σε αερόλυμα καυσαερίων κινητήρα οχημάτων είτε σε νανοσωματίδια οξειδίου του Δημητρίου (CeO2). Πραγματοποιήθηκαν εκθέσεις κυψελιδικών επιθηλιακών κυττάρων και κυττάρων αίματος σε απαέρια εξάτμισης κινητήρα Diesel για να προσδιοριστεί εάν οι τεχνολογίες ελέγχου εκπομπών Diesel (είτε συστήματος οξειδωτικού μετατροπέα, Diesel Oxidation Catalyst (DOC) σε σειρά με φίλτρο αιθάλης, Diesel Particulate Filter (DPF), είτε με τον εμπλουτισμό του καυσίμου ντίζελ με πρόσθετο καυσίμου CeO2) επηρεάζουν τις ανοσορρυθμιστικές αντιδράσεις των κυττάρων. Τέλος, προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση της κατανομής μεγέθους σωματιδίων καυσαερίων σε βιολογικές αποκρίσεις (δραστηριότητα υποκινητή της κυτοκίνης, έκκριση κυτοκίνης και βιωσιμότητα κυττάρων), οργανώθηκαν πειράματα με τη λειτουργία του συστήματος SPS -MEC.Συμπερασματικά, το σύστημα δειγματοληψίας που αναπτύχθηκε παρουσιάζει σταθερό λόγο αραίωσης, ικανότητα απομάκρυνσης πτητικών ενώσεων > 99% και χαρακτηρίζεται από ελάχιστες απώλειες σωματιδίων (η διείσδυση στερεών σωματιδίων έως 10 nm είναι υψηλότερη από 80%) ακόμη και στα μικρότερα μεγέθη σωματιδίων. Οι μετρήσεις της ικανότητας φόρτισης σωματιδίων με την εφαρμογή του φωτοηλεκτρικού φορτιστή (UV-PEC) με βάση το όριο φωτονιονισμού (μήκος κύματος φωτός UV) μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση του χημικού αποτυπώματος πολυαρωματικών υδρογονανθράκων στα σωματίδια των καυσαερίων. Ο συνδυασμός SPS -MEC αποτελεί καινοτόμο σύστημα για την σταθερή και γρήγορη αξιολόγηση επιλεγμένων μεγεθών ροής νανοσωματιδίων που εκτίθενται σε in vitro καλλιέργειες κυττάρων. Αποδεικνύεται ότι τα μικρότερα σωματίδια με μέση διάμετρο μεγέθους τα 54 nm παρουσιάζουν αυξημένη παραγωγή κυτοκινών, σε σχέση με κατανομές μεγαλύτερου μεγέθους σωματιδίων. Τέλος τα πρόσθετα καυσίμου -ακόμη και σε μικρές συγκεντρώσεις στο καύσιμο diesel- εμφανίζονται να έχουν επίδραση στην υγεία του ανθρώπου καθώς αυξάνουν την παραγωγή ενώσεων ROS.