Isolation of bacteria that degrade carbamate insecticides and characterization of the functional and ecological role of bacterial genes involved in their hydrolysis in soil

Abstract

Synthetic carbamates constitute a significant pesticide group with oxamyl being a leading compound in the insecticide/nematicide market. Microbial degradation constitutes one of the main processes controlling the environmental dissipation of oxamyl. Paradoxically, microbial degradation, which was initially viewed as a desirable process for reducing environmental hazards, has turned into a double-edged sword with the development of the phenomenon of enhanced microbial degradation, which under conducive condition can lead to loss of the biological efficacy of pesticides. Considering the importance of biodegradation in the environmental fate and efficacy of soil-applied carbamate insecticides we aimed (1) to isolate and identify bacteria degrading the carbamate oxamyl and to characterize the genes involved in its transformation, (2) to explore the ecology, distribution and function of carbamate hydrolase genes in soils and (3) to get insights into their origin and evolutionAs a source for the isolation of oxamyl-degrading bacteria we used a soil from a commercial banana plantation located in the area of Sitia, northeast Crete, in Greece with history of previous treatment with oxamyl. A rapid microbially driven hydrolysis of oxamyl to oxamyl oxime was observed in the studied soil which is in line with the reduced biological efficacy of oxamyl in the given field. Subsequent enrichment cultures inoculated with the studied soil resulted in the isolation of four oxamyl-degrading bacterial strains which identified, based on multilocus sequence analysis (MLSA), as Pseudomonas. The isolates were able to metabolize oxamyl to oxamyl oxime which was not further transformed by our strains in contrast to its gradual dissipation in soil. Soil sterilization resulted in a complete halting of the degradation of oxamyl oxime suggesting that its transformation was biologically driven. However, our repeated attempts to isolate oxamyl oxime degraders following the same enrichment cultures method failed, suggesting that its transformation in soil is probably a co-metabolic process performed by non-specialized soil bacteria or fungi. All the isolated strains carried the carbamate-hydrolase gene cehA which was shown, via transcription analysis, to be responsible for the hydrolysis of oxamyl. Our isolates were able to utilize the methyl carbamate moiety (released during hydrolysis of oxamyl) as a C and N source, in agreement with the high mineralization levels of the 14C-carbomoyl-labelled oxamyl by all isolates, and their capacity to grow on methylamine, that is released from the decomposition of the unstable methyl-carbamate moiety. We extended our investigations from the in vitro bacterial hydrolysis of oxamyl to the role of the soil microbiota in the in situ biodegradation of carbamates in soils. We studied the degradation of oxamyl and we determined the abundance of the three most studied carbamate hydrolase genes cehA, mcd and cahA in 16 soils from a potato monoculture area in Greece where oxamyl is regularly used. Oxamyl showed low persistence (DT50 = 2.4-26.7 days) and qPCR detected the cehA and mcd genes in 10 and three of the studied soils, respectively. The abundance of the cehA gene was positively correlated with pH, while both cehA abundance and pH were negatively correlated with oxamyl DT50. In light of the detection of mcd in the studied soils, despite the absence of carbofuran, its main substrate which has been banned and has not been used in the studied region for over 10 years, we tested the hypothesis that other carbamates used in the region might serve as substrates for mcd. None of the alternative carbamates tested increased the abundance of cehA and mcd apart from (i) oxamyl which stimulated the abundance and expression only of the cehA gene and (ii) carbofuran that stimulated the abundance and expression of both genes suggesting an interesting catabolic functional redundancy first time reported for carbamates. The cehA gene was also detected in pristine soils upon repeated treatments with oxamyl and carbofuran and only in soils with pH ≥ 7.2, where the most rapid degradation of oxamyl was observed. The occurrence of cehA gene in agricultural and pristine soils suggested its widespread distribution that could be a result of a parallel evolutionary mechanism from a common ancestor, probably involved in the detoxification of natural carbamate soil compounds produced by soil microorganisms and plant roots. Overall, we studied the degradation of oxamyl by oxamyl-degrading bacteria and its biodegradation in soils. We reported the isolation and identification of four oxamyl-degrading Pseudomonas strains and we determined the microbial transformation pathway of oxamyl. All isolates carried the cehA gene which was shown to be responsible for the hydrolysis of oxamyl. Soil microcosm studies further reinforced the role of cehA gene in the biodegradation of oxamyl, whereas both the cehA and mcd genes are involved in the biodegradation of carbofuran. The detection of the cehA gene in agricultural and pristine soils, after oxamyl and carbofuran application suggests its widespread occurrence and stresses the significant role of pH as a driver of the distribution of the cehA in soils. These results have major implications regarding the maintenance of carbamate hydrolase genes in soils, have practical applications regarding the agricultural use of carbamates and provide insights into the evolution of cehA gene.

Τα συνθετικά καρβαμιδικά αποτελούν μια σημαντική ομάδα γεωργικών φαρμάκων με το oxamyl να είναι o κύριος εκπρόσωπος τους σήμερα στην αγορά εντομοκτόνων/νηματοδοκτόνων. Η μικροβιακή αποδόμηση αποτελεί μία από τις κύριες διεργασίες που ελέγχει την περιβαλλοντική τύχη του oxamyl. Παραδόξως, η μικροβιακή αποδόμηση, η οποία αρχικά θεωρήθηκε ως μια επιθυμητή διεργασία για τη μείωση των περιβαλλοντικών κινδύνων, έχει μετατραπεί σε δίκοπο μαχαίρι με την ανάπτυξη του φαινομένου της επιταχυνόμενης μικροβιακής αποδόμησης, η οποία υπό ευνοϊκές συνθήκες μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της αποτελεσματικότητας των γεωργικών φαρμάκων. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημασία της βιοαποδόμησης στην περιβαλλοντική τύχη και στην αποτελεσματικότητα των καρβαμιδικών εντομοκτόνων που εφαρμόζονται στο έδαφος στοχεύσαμε (1) στην απομόνωση και ταυτοποίηση βακτηρίων που αποδομούν το καρβαμιδικό oxamyl και στον χαρακτηρισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στη αποδόμησή του, (2) στην διερεύνηση της οικολογίας, της κατανομής και της λειτουργίας των γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες των καρβαμιδικών σε γεωργικά εδάφη και (3) στη διερεύνηση της προέλευσης και των μηχανισμών εξέλιξης των συγκεκριμένων γονιδίων. Ως πηγή για την απομόνωση βακτηρίων που αποδομούν το oxamyl χρησιμοποιήσαμε έδαφος από μια εμπορική καλλιέργεια μπανάνας που βρίσκεται στην περιοχή της Σητείας, βορειοανατολικά της Κρήτης, στην Ελλάδα με ιστορικό προηγούμενων εφαρμογών oxamyl. Παρατηρήθηκε ταχύτατη μικροβιακή υδρόλυση του oxamyl σε oxamyl oxime στο υπό μελέτη έδαφος η οποία είναι σε συμφωνία με την μειωμένη αποτελεσματικότητα του oxamyl στον συγκεκριμένο αγρό. Επακόλουθες καλλιέργειες εμπλουτισμού εμβολιασμένες με το υπό μελέτη έδαφος οδήγησαν στην απομόνωση τεσσάρων βακτηριακών στελεχών που αποδομούν το oxamyl τα οποία ταυτοποιήθηκαν, με βάση την ανάλυση αλληλουχίας πολλαπλών γενετικών τόπων (MLSA), ως Pseudomonas. Τα απομονωθέντα βακτήρια ήταν ικανά να μεταβολίζουν το oxamyl σε oxamyl oxime το οποίο δεν μετασχηματίστηκε περαιτέρω από τα στελέχη μας σε αντίθεση με την σταδιακή του αποδόμηση του στο έδαφος. Η αποστείρωση του εδάφους είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη ανάσχεση της αποδόμησης του oxamyl oxime υποδηλώνοντας ότι ο μετασχηματισμός του ήταν βιολογικά εξαρτώμενος. Ωστόσο, οι επαναλαμβανόμενες προσπάθειες μας να απομονώσουμε βακτήρια που διασπούν το oxamyl oxime ακολουθώντας την ίδια μέθοδο εμπλουτισμένων καλλιεργειών απέτυχαν, υποδηλώνοντας ότι ο μετασχηματισμός του στο έδαφος είναι πιθανώς μια συμμεταβολική διεργασία που εκτελείται από μη εξειδικευμένα βακτήρια ή μύκητες. Όλα τα απομονωθέντα βακτηριακά στελέχη έφεραν το γονίδιο cehA που κωδικοποιεί μια καρβαμιδική υδρολάση και το οποίο δείχθηκε, μέσω μεταγραφικής ανάλυσης, να είναι υπεύθυνο για την υδρόλυση του oxamyl. Τα απομονωθέντα στελέχη μπορούσαν να χρησιμοποιούν την ομάδα του μεθυλοκαρβαμικού οξέος (που απελευθερώνεται κατά την διάρκεια της υδρόλυσης του oxamyl) ως πηγή C και N, σε συμφωνία με τα υψηλά επίπεδα ανοργανοποίησης του σημασμένου oxamyl με 14C στο καρβαμικό τμήμα από όλα τα στελέχη, και την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε μεθυλαμίνη, η οποία ελευθερώνεται από την διάσπαση της ασταθούς ομάδας του μεθυλοκαρβαμικού οξέος. Επεκτείναμε τις έρευνές μας από την in vitro βακτηριακή υδρόλυση του oxamyl στο ρόλο της μικροβιακής κοινότητας του εδάφους στην in situ βιοδιάσπαση των καρβαμιδικών στο έδαφος. Μελετήσαμε την διάσπαση του oxamyl και καθορίσαμε την αφθονία των τριών πιο μελετημένων γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες καρβαμιδικών cehA, mcd και cahA σε 16 εδάφη από μια περιοχή μονοκαλλιέργειας πατάτας στην Ελλάδα, όπου το oxamyl χρησιμοποιείται συχνά. Το oxamyl έδειξε χαμηλή υπολειμματικότητα (DT50 = 2.4-26.7 ημέρες) και μέσω qPCR ανιχνεύσαμε τα γονίδια cehA και mcd σε 10 και 3 από τα εδάφη που μελετήθηκαν, αντίστοιχα. Η αφθονία του cehA γονιδίου εμφάνισε σημαντική θετική συσχέτιση με το pH, ενώ και η αφθονία του cehA και το pH εμφάνισαν σημαντική αρνητική συσχέτιση με το DT50 του oxamyl. Λαμβάνοντας υπόψη την ανίχνευση του mcd στα μελετούμενα εδάφη, παρά την απουσία του carbofuran, του κυριότερου υποστρώματός του, του οποίου η χρήση έχει απαγορευθεί και δεν χρησιμοποιήθηκε στην υπό μελέτη περιοχή τουλάχιστον τα τελευταία 10 έτη, εξετάσαμε την υπόθεση ότι άλλα καρβαμιδικά που χρησιμοποιήθηκαν στη περιοχή θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως υποστρώματα για το mcd. Κανένα από τα εναλλακτικά καρβαμιδικά που δοκιμάστηκαν δεν οδήγησε σε αύξηση της αφθονίας των γονιδίων cehA και mcd εκτός από (i) το oxamyl το οποίο προκάλεσε αύξηση της αφθονίας και της έκφρασης μόνο του cehA γονιδίου και (ii) το carbofuran που οδήγησε σε αύξηση της αφθονίας και της έκφρασης και των δύο γονιδίων υποδηλώνοντας έναν ενδιαφέρον καταβολικό λειτουργικό πλεονασμό ο οποίος αναφέρεται πρώτη φορά για καρβαμιδικά εντομοκτόνα εδάφους. Το cehA γονίδιο ανιχνεύθηκε επίσης σε μη γεωργικά εδάφη (που δεν είχαν εκτεθεί ποτέ σε συνθετικά καρβαμιδικά) μετά από επαναλαμβανόμενες εφαρμογές oxamyl και carbofuran και μόνο σε εδάφη με pH ≥ 7.2, όπου παρατηρήθηκε η πιο ταχεία αποδόμηση του oxamyl. Η ύπαρξη του γονιδίου cehA σε γεωργικά που έχουν εκτεθεί σε συνθετικά καρβαμιδικά εντομοκτόνα και σε μη γεωργικά εδάφη που δεν έχουν εκτεθεί σε συνθετικά καρβαμιδικά υποδεικνύει την ευρεία κατανομή του συγκεκριμένου γονιδίου που θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα ενός παράλληλου εξελικτικού μηχανισμού από έναν κοινό πρόγονο, πιθανότατα εμπλεκόμενου στην αποτοξικοποίηση φυσικών καρβαμιδικών ενώσεων που παράγονται στο έδαφος από μικροοργανισμούς και φυτά. Συνολικά, μελετήσαμε την αποδόμηση του oxamyl από βακτήρια που έχουν την ικανότητα να διασπούν το oxamyl και την μικροβιακή αποδόμηση του σε εδάφη. Αναφέραμε την απομόνωση και την ταυτοποίηση τεσσάρων στελεχών Pseudomonas με την ικανότητα να αποδομούν το oxamyl και προσδιορίσαμε το μονοπάτι του μικροβιακού μετασχηματισμού του oxamyl. Όλα τα στελέχη έφεραν το γονίδιο cehA το οποίο δείχθηκε να είναι υπεύθυνο για την υδρόλυση του oxamyl. Περαιτέρω μελέτες σε δείγματα εδάφους επιβεβαίωσαν το ρόλο του γονιδίου cehA στη διάσπαση του oxamyl, ενώ και τα δύο γονίδια cehΑ και mcd εμπλέκονται στην αποδόμηση του carbofuran. H ανίχνευση του γονιδίου cehA σε γεωργικά και μη γεωργικά εδάφη, μετά από εφαρμογή oxamyl υποδηλώνει την ευρεία εμφάνισή του και τονίζει τον σημαντικό ρόλο του pH στην κατανομή του cehA στα εδάφη. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναμένεται να έχουν σημαντικές συνέπειες σχετικά με την διατήρηση γονιδίων που κωδικοποιούν υδρολάσες καρβαμιδικών σε εδάφη, έχουν πρακτικές εφαρμογές σχετικά με την γεωργική χρήση των καρβαμιδικών και παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη του γονιδίου cehA.