Design of protein and peptide materials for use in nanotechnological applications

Abstract

Protein and peptide materials with a defined morphology are increasingly used in a wide area of applications. Advantages that characterize proteinaceous biomaterials are their inherent biocompatibility, biodegradability and flexibility of their design and fabrication. The present thesis is focused on the design and study of such biomaterials using as model system a natural fibrous protein, the adenovirus fiber. The adenovirus fiber protein is a homotrimer consisting of an N-terminal tail, a long shaft, and a C-terminal knob region that is responsible for high-affinity receptor binding. Α series of constructs were designed having as template the shaft segment of the Ad2 fiber protein and inserting functionalities through molecular cloning techniques. The chimeric proteins were rendered more stable and were targeted for potential use as delivery agents and gene therapy applications. Amyloid fibrils, derived from the studied adenovirus shaft sequences and from a common sequence to Alzheimer’s Aβ peptide and HIV-1 V3 loop, due to their intrinsic mechanical properties are excellent candidates for use as scaffolds. By applying computational methods, the peptides can be rationally designed through mutation of regions amenable to modification aiming at the fabrication of biomaterials with ‘on-demand’ functionalities. An essential part of this PhD study was focused on the experimental study of two rationally and computationally designed peptides that are positively charged and have the ability to bind DNA and internalize the cell while carrying the packaged plasmid DNA. In another aspect of this study instead of exploiting amyloid fibrillization advantages, we sought to inhibit or hinder the process of amyloid fibril formation. The designed peptide was inspired from the aforementioned natural sequences. This peptide despite its similarity with amyloid-forming sequences, contains the beta breaker residue (proline) and as a result fails to self-assemble into amyloid fibrils and can provide information that could serve as the basis for structure-based design of potential inhibitors of amyloid formation.

Τα πρωτεϊνικά και πεπτιδικά υλικά με καθορισμένη μορφολογία χρησιμοποιούνται σε μια ευρεία περιοχή εφαρμογών. Τα πλεονεκτήματα τους ειναι η έμφυτη βιοσυμβατότητα τους, η βιοαποκοδομησιμότητα τους και η ευελιξία του σχεδιασμού και της κατασκευής τους. Η παρούσα διδακτορική εργασία επικεντρώνεται στο σχεδιασμό και τη μελέτη τέτοιων βιοϋλικών χρησιμοποιώντας ως πρότυπο σύστημα μια φυσική ινώδη πρωτεΐνη, την ίνα του αδενοϊού τύπου 2. Η ίνα του αδενοϊού ειναι μια ομοτριμερής πρωτεΐνη που αποτελείται από ένα Ν-τελικό άκρο, ένα λεπτό κεντρικό μίσχο και ενα C-τελικό άκρο, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη προσκόλληση του ιού στους υποδοχείς των κυττάρων. Έχοντας ως εκμαγείο το μίσχο της Αd2 ίνας και εισάγοντας λειτουργικά χαρακτηριστικά μέσω τεχνικών μοριακής κλωνοποίησης, σχεδιάστηκε μια σειρά νέων υβριδικών πρωτεϊνών. Οι χιμαιρικές αυτές πρωτεΐνες καθίστανται πιο σταθερές και δυνητικά θα μπορούσαν να βρούνε χρήση ως μεταφορείς φαρμάκων καθώς επίσης και σε εφαρμογές γονιδιακής θεραπείας. Τα αμυλοειδή ινίδια που προέρχονται από τις μελετημένες αλληλουχίες του μίσχου της ίνας του αδενοϊού και από μια κοινή αλληλουχία στο Αβ πεπτίδιο του Αlzheimer και στον V3 βρόγχο του HIV-1, λόγω των εγγενών μηχανικών τους ιδιοτήτων ειναι ιδανικά για χρήση ως ικριώματα. Με την εφαρμογή υπολογιστικών μεθόδων, τα πεπτίδια μπορούν να σχεδιαστούν ορθολογικά με την μετάλλαξη επιδεκτικών σε τροποποιήσεις περιοχών, με στόχο την κατασκευή βιοϋλικών με «κατ 'απαίτηση» λειτουργίες. Ένα σημαντικό μέρος αυτής της μελέτης επικεντρώνεται στην πειραματική μελέτη δυο ορθολογικά και υπολογιστικά σχεδιασμένων πεπτιδίων που είναι θετικά φορτισμένα και έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν DNA και να εισέρχονται στο κύτταρο ενώ μεταφέρουν το ‘πακεταρισμένο’ πλασμιδιακό DNA. Όσον αφορά μια άλλη πτυχή αυτής της διδακτορικής μελέτης, αντί να εκμεταλλευτούμε τα πλεονεκτήματα της αμυλοείδωσης, επιδιώξαμε να αναστείλουμε τη διαδικασία σχηματισμού αμυλοειδών ινιδίων. Το πεπτίδιο που σχεδιάστηκε ήταν εμπνευσμένο από τις προαναφερθείσες φυσικές αλληλουχίες. Παρά την ομοιότητα του με τις αλληλουχίες που σχηματίζουν αμυλοειδή ινίδια, περιέχει το αμινοξύ προλίνη, το οποίο θεωρείται αναστολέας της δημιουργίας των β-φύλλων. Το σχεδιασμένο αυτο πεπτίδιο δεν αυτο-οργανώνεται σε β-φύλλα αλλά επιπλέον καθυστερεί ή διακόπτει την αυτο-οργάνωσης του Αβ πεπτιδίου σε αμυλοειδή ινίδια. Επομένως παρέχει πληροφορίες που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως βάση για -δομικά βασιζόμενο- σχεδιασμό πιθανών αναστολέων της αμυλοείδωσης.