Μηχανισμοί δράσης εδαφικών ενδοφυτικών μυκήτων που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του φυτού και στην απόκριση σε αβιοτικές καταπονήσεις

Abstract

The importance of beneficial microorganisms both in shaping the soil structure and for plant growth has been known for many years. Microorganisms that colonize plant roots either externally or internally appear to play a very important role in plant growth as well as resistance to abiotic and biotic stresses. Plants of the legume family enter into symbiotic relationships with microorganisms (rhizobia, arboreal mycorrhizal fungi), which are mainly mutually beneficial but can also become parasitic. In this particular doctoral thesis, a nonpathogenic endophytic fungus of the genus Fusarium solani strain K, also known as FsK, and the legume model plant Lotus japonicus will be studied. The ascomycete FsK is an endophyte originally isolated from tomato plant roots, and soon became the subject of study, thanks to its ability to increase plant resistance to both biotic stress, for example from the foliar pathogen Septoria lycopersici, and abiotic stress due to lack of water. Recent studies of the plant-fungus interaction at the subcellular level have shown that the establishment of FsK int he tissues of leguminous plants requires a series of changes involving both adaptations to the growth of the fungus and autonomous plant cell responses. Most of these changes have been described for both symbiotic interactions and pathogenicity relationships between plants and microorganisms. We also know that the growth of the fungus inside the plant is neither burdensome nor beneficial, when they grow under normal growth conditions and without the application of any stress. A first question that this PhD thesis set out to answer was whether the plant-fungus interaction is beneficial to the plant in conditions of abiotic stress. The ability of the endophyte to offer resistance to plants growing under conditions of heat, cold and oxidative stress was investigated in the first phase. The endophyte is capable of colonizing the roots of leguminous plants under abiotic stress conditions but to a lesser extent than under normal growth conditions. We also observed that shoot biomass increased in the presence of the endophyte under cold stress while FsK affects plant growth through increasing root length under oxidative stress. In order to gain a more complete picture of the FsK-Lotus relationship, the effect of the fungus on plant growth under iron deficiency conditions was also tested. In this particular case FsK is still able to promote plant growth through shoot and root fresh weight, and plants inoculated with the fungus showed a shorter flowering time under abiotic stress conditions. In addition, the endophytic fungus enhanced the uptake of macronutrients(P, K, Ca and Mg) and micronutrients (Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, Ni) by plants without stress conditions. All the above results were complemented by studying the transcriptional profile of FsK-inoculated plants, in the early stages of the interaction. A large number of transcripts were identified as differentially expressed from both the plant and fungal sides. So knowing that the fungus helps prevent nutrients from the plant we checked for iron-related fungal genes. The results showed that the fungus has a high-affinity iron uptake pathway. Alongside the study of the interaction of the endophytic fungal strain, Fusarium solani strain K, with the model plant Lotus japonicus, under conditions of abiotic stress, we also studied the effect of triterpenes on its colonization capacity. We know that secondary metabolites are known to act in important plant functions, such as protection against biotic and abiotic agents as well as the establishment of symbiotic relationships. Triterpenes are the most important group of defense metabolites against fungi and pathogens. The investigation of the biosynthesis of triterpenes and specifically the role of β-amyrin synthase, LjAMY2 is part of the laboratory's research as it has been proven to date that it is the only enzyme that catalyzes the synthesis of lupeol and β-amyrin. Recent laboratory results have also shown that the endophytic fungus is recognized by the plant in a similar way to rhizobacteria and mycorrhizal fungi and is capable of inducing the known Common Symbiotic Signaling Pathway (CSSP).Having these data, the next goal of the PhD was to answer the question of whether the colonization ability of FsK is affected by the triterpene biosynthetic pathway and how it affects the process of nodulation. For this purpose, Lotus japonicus mutant plants and specific mutants of the AMY2.188.1 and CYP71D353 genes were used. The fungus is able to colonize the roots of the mutant plants while we also observe a cooperative action of the rhizobia with the fungus in the nodulation process only in wild-type plants. Finally, all the above results come to complement and confirm the beneficial symbiotic relationship of the endophyte with the leguminous plant. Additionally, the results of cooperative action and coexistence with rhizobacteria remind us that the study of this beneficial endophytic fungus is worthy of investigation.

Εδώ και πολλά χρόνια είναι γνωστή η σημασία των ωφέλιμων μικροοργανισμών τόσο στη διαμόρφωση της δομής του εδάφους όσο και για την ανάπτυξη των φυτών. Οι μικροοργανισμοί που αποικίζουν τη ρίζα των φυτών είτε εξωτερικά είτε και εσωτερικά φαίνεται ότι διαδραματίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του φυτού καθώς και στην αντοχή έναντι αβιοτικών και βιοτικών καταπονήσεων. Τα φυτά της οικογένειας των ψυχανθών συνάπτουν συμβιωτικές σχέσεις με μικροοργανισμούς (ριζόβια, δενδρόμορφοι μυκορριζικοί μύκητες), οι οποίες είναι κυρίως αμοιβαία επωφελής όμως μπορεί να γίνουνκαι παρασιτικές. Στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή θα μελετηθεί ένας μη παθογόνος ενδοφυτικός μύκητας του γένους Fusarium solani στέλεχος Κ, γνωστός και ως FsK, και το φυτό μοντέλο των ψυχανθών Lotus japonicus. Ο ασκομύκητας FsK είναι ένα ενδόφυτο που αρχικά απομονώθηκε από ρίζες φυτών ντομάτας, και σύντομα αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης, χάρις την ικανότητά του να αυξάνει την αντίσταση των φυτών έναντι τόσο σε βιοτική καταπόνηση, για παράδειγμα από το παθογόνο του φυλλώματος Septoria lycopersici, όσο και σε αβιοτική καταπόνηση, λόγω έλλειψης νερού. Πρόσφατες μελέτες της αλληλεπίδραασης φυτού-μύκητα σε υποκυτταρικό επίπεδο έδειξαν ότι η εγκαθίδρυση του FsK στους ιστούς των ψυχανθών φυτών, απαιτεί μια σειρά αλλαγών που αφορούν τόσο προσαρμογές στην ανάπτυξη του μύκητα αλλά και αυτόνομες αποκρίσεις των φυτικών κυττάρων. Οι περισσότερες από αυτές τις αλλαγές έχουν περιγραφεί τόσο για συμβιωτικές αλληλεπιδράσεις όσο και για σχέσεις παθογένειας μεταξύ φυτών και μικροοργανισμών. Επίσης γνωρίζουμε ότι η ανάπτυξη του μύκητα εντός του φυτού δεν είναι ούτε επιβαρυντική αλλά ούτε και ευεργετική, όταν αναπτύσσονται υπό φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης καιχωρίς εφαρμογή κάποιας καταπόνησης. Ένα πρώτο ερώτημα που έθεσε η παρούσα διδακτορική διατριβή να απαντήσει ήταν αν η αλληλεπίδραση φυτού-μύκητα είναι ωφέλιμη προς το φυτό σε συνθήκες αβιοτικού στρες. Διερευνήθηκε σε πρώτη φάση η ικανότητα του ενδόφυτου να προσφέρει αντίσταση στα φυτά που αναπτύσσονται υπό συνθήκες ζέστης, ψύχους όπως και οξειδωτικού στρες. Το ενδόφυτο είναι ικανό να αποικίζει τις ρίζες των ψυχανθών φυτών και υπό συνθήκες αβιοτικού στρες όμως σε μικρότερο βαθμό σε σχέση με τις κανονικές συνθήκες ανάπτυξης. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η βιομάζα των βλαστώναυξήθηκε παρουσία του ενδοφύτου υπό ψυχρή καταπόνηση ενώ ο FsK επηρεάζει την ανάπτυξη των φυτών μέσω της αύξησης του μήκους της ρίζας υπό οξειδωτικό στρες. Προκειμένου να αποκτηθεί μια πληρέστερη εικόνα της σχέσης FsK-Lotus ελέγχθηκε και η επίδραση του μύκητα στην ανάπτυξη των φυτών κάτω από συνθήκες έλλειψης σιδήρου. Στην συγκεκριμένη περίπτωση ο FsK εξακολουθεί να είναι ικανός να προάγει την ανάπτυξη των φυτών μέσω του νωπού βάρους των βλαστών και των ριζών και τα φυτά που εμβολιάστηκαν με μύκητα παρουσίασαν συντομότερο χρόνο άνθησης υπό συνθήκες αβιοτικού στρες. Επιπλέον ο ενδοφυτικός μύκητας ενίσχυσε την πρόσληψη μακροθρεπτικών στοιχείων από τα φυτά (P, K, Ca και Mg) και μικροθρεπτικών συστατικών (Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Co, Ni) χωρίς συνθήκες στρες. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα συμπληρώθηκαν με τη μελέτη του μεταγραφικού προφίλ των εμβολιασμένων με FsK φυτών, στα πρώιμα στάδια της αλληλεπίδρασης. Ένας μεγάλος αριθμός μεταγραφημάτων εντοπίστηκε ως διαφορικά εκφραζόμενος τόσο από τη πλευρά του φυτού όσο και από τη πλευρά του μύκητα. Γνωρίζοντας λοιπόν ότι ο μύκητας βοηθάει στην πρόληψη θρεπτικών στοιχείων από το φυτό ελέγξαμε για γονίδια του μύκητα που σχετίζονται με το σίδηρο. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο μύκητας διαθέτει μία οδό πρόσληψης σιδήρου υψηλής συγγένειας. Παράλληλα με τη μελέτη της αλληλεπίδρασης του ενδοφυτικού μυκητιακού στελέχους, Fusarium solani στέλεχος Κ, με το φυτό μοντέλο Lotus japonicus, υπό συνθήκες αβιοτικού στρες, μελετήσαμε και την δράση τριτερπενίων στην ικανότητα αποικισμού του. Γνωρίζουμε ότι οι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι γνωστοί για τη δράση τους σε σημαντικές λειτουργίεςτου φυτού, όπως είναι η προστασία από βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες καθώς και η εγκαθίδρυση συμβιωτικών σχέσεων. Τα τριτερπένια αποτελούν τη σημαντικότερη ομάδα αμυντικών μεταβολιτών ενάντια σε μύκητες και παθογόνα. Η διερεύνηση της βιοσύνθεσης των τριτερπενίων και συγκεκριμένα του ρόλου της συνθάσης της β-αμυρίνης, LjAMY2 αποτελεί κομμάτι έρευνας του εργαστηρίου καθώς έχει αποδειχθεί μέχρι σήμερα ότι αποτελεί το μοναδικό ένζυμο που καταλύει την σύνθεση της λουπεόλης και της β-αμυρίνης. Πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου έδειξαν επίσης ότι ο ενδοφυτικός μύκητας αναγνωρίζεται από το φυτό με παρόμοιο τρόπο που αναγνωρίζονται τα ριζοβακτήρια και οι μυκορριζικοί μύκητες και είναι ικανός να επάγει το γνωστό μονοπάτι Common Symbiotic Signaling Pathway (CSSP). Έχοντας αυτά τα δεδομένα, ο επόμενος στόχος του διδακτορικού ήταν να απαντήσει στο ερώτημα αν η ικανότητα αποικισμού του FsK επηρεάζεται από το βιοσυνθετικό μονοπάτι των τριτερπενίων και πως επιδρά στη διαδικασία της φυματιογένεσης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν μεταλλαγμένα φυτά Lotus japonicus και συγκεκριμένα μεταλλάγματα των γονιδίων AMY2.188.1 και CYP71D353 (CYP71-753). Ο μύκητας είναι ικανός να αποικίζει τις ρίζες των μεταλλαγμένων φυτών ενώ επίσης παρατηρούμε μία συνεργατική δράση του ριζοβίου με το μύκητα στη διαδικασία της φυματιογένεσης μόνο σε φυτά αγρίου τύπου. Τέλος, όλα τα παραπάνω αποτελέσματα έρχονται να συμπληρώσουν και να επιβεβαιώσουν την ωφέλιμη συμβιωτική σχέση του ενδόφυτου με το ψυχανθές φυτό. Συμπληρωματικά και τα αποτελέσματα της συνεργατικής δράσης και συνύπαρξης με ριζοβακτήρια μας υπενθυμίζουν ότι η μελέτη αυτού του ωφέλιμου ενδοφυτικού μύκητα είναι άξια διερεύνησης.