Γονίδια παθογένειας στο μύκητα Verticillium dahliae: μοριακή διερεύνηση και προσδιορισμός του ρόλου τους στην αλληλεπίδραση με το φυτό ξενιστή

Abstract

This doctoral study attempts to unravel molecular mechanisms utilized by the fungus Verticillium dahliae, in its quest to manifest pathogenic activity in the plant host. Previous research in phytopathogenic fungi has demonstrated that the genes coding for the transmembrane receptor PTH11 (a G protein coupled receptor) and the F-box protein Frp1, are involved, the first in extracellular signal sensing, and the second in the induction of cell wall degrading enzymes. Functional study of the homologs of the above - mentioned genes in V. dahliae virulence (henceforth called Vpth and Vrp respectively), was performed via reverse genetics, with the genes being either disrupted or overexpressed in the genome of the fungus. In both cases, the disruption was attempted via gene replacement, a technique based on homologous recombination. For that purpose, replacement alleles were constructed, where the gene sequence was disrupted by genes conferring resistance to the antibiotics, hygromycin B in the case of Vpth, and geneticin in the case of Vrp. At the same time, complementation cassettes were constructed with the final aim of restoring the endogenous genes in the genomes of mutant strains. Disruption of the Vpth gene was performed in the wild type VdLs.17 strain (non - defoliating pathotype), however Vrp disruption was not successful when attempted in the 70V (non - defoliating pathotype) and 22V (T9) (defoliating pathotype) strains. Regarding the gene overexpression, in the Vpth case, it was attempted in an indirect fashion, where the reintroduction cassette was inserted in the genome of various wild type strains. Meanwhile, for the Vrp gene, a fusion of its sequence with the green fluorescent protein EGFP was constructed and set under the control of the strong Magnaporthe grisea ribosomal protein promoter. For both genes under study, mutant strains were obtained by transformation of the wild type 70V and 22V (T9) strains, belonging to the non – defoliating and defoliating pathotypes respectively. Disruption of the Vpth gene reduced mycelial growth, microclerotia production and conidiation. At the same time, it caused a significant decrease in the fungus’s pathogenic ability, with less symptoms occurring in assays performed on plant hosts. Insertion of additional copies of the Vpth gene on the other hand, led to a variable increase in the gene’s expression among the obtained strains and affected virulence differentially, an occurance that can be linked to the disparate position of the inserts in the genomes. In the case of the Vrp gene, overexpression under a strong promoter, led to the acquisition of mutant strains with a significant increase in pathogenicity compared to their respective wild types. Differences were detected regarding mycelial growth and conidiation of the Vrp mutants, in media containing different mono- or polysaccharides. Additionally, a pectin substrate consumption assay, revealed an increased pectin lyase production in all the mutant isolates. The following part of the thesis, centered on the study of a member of the NLP protein family, called VdNEP, whose secretion by V. dahliae contributes to the development of Verticillium wilt symptoms via necrosis and ethylene production. In order to localize the protein’s site of action, a fusion of the VdNEP gene with the gene coding for the green fluorescent protein EGFP, was constructed and set under the control of the M. grisea ribosomal protein promoter. The construct was inserted into the genomes of wild type strains 25V (SS4), 70V and 22V (T9), with the mutant strains obtained further transformed with the red fluorescent protein AsRed. Subsequent microscopy enabled the localization at the cellular level, but primarily at the host plant level, of the secretion and trafficking of the VdNEP protein. At the same time, the expression levels of the VdNEP as well as the other genes analyzed in this study, were determined in the 25V (SS4) and 22V (T9) strains, after growth in conditions simulating the xylem sap of the plant hosts. Differences were detected, not only between time points, but also between the strains belonging to the different pathotypes. Lastly, the possibility of utilizing the VdNEP gene as a basis for the development of a molecular marker, that would enable rapid and efficient detection of the pathogen’s isolates belonging to the extremely destructive defoliating pathotype, was investigated. As such, after initial results derived from Southern blottings, where the VdNEP was detected in different genomic fragments between isolates of the two pathotypes, the sequences bordering the gene were selected for isolation via Inverse PCR from the genomes of several strains. Comparison of the obtained sequences, led to the detection of polymorphisms in the VdNEP 3΄ untranslated region (3΄- UTR) between the reference strains for the defoliating and non – defoliating pathotypes. Based on these polymorphisms, primers were designed and evaluated in a range of isolates for their ability to categorize the strains into the respective pathotypes. The results indicate the suitability of the new molecular marker as a reliable tool for the classification of V. dahliae isolates. Considering the crucial regulatory role that the 3΄ untranslated regions have in the stability, cellular localization and final translation of mRNAs, the detection of the above - mentioned polymorphisms suggests a possible involvement of this gene in the onset of the defoliating pathotype and opens a wider field of research.

Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, επιχειρήθηκε η διερεύνηση μοριακών μηχανισμών που αξιοποιούνται από το μύκητα Verticillium dahliae για την εκδήλωση της παθογόνου δράσης του. Προηγούμενες ερευνητικές εργασίες σε φυτοπαθογόνους μύκητες, έχουν αποδείξει ότι τα γονίδια του διαμεμβρανικού υποδοχέα PTH11 (ένας συζευγμένος με G πρωτεΐνες υποδοχέας) και της F-box πρωτεΐνης Frp1 διαδραματίζουν ρόλο, το μεν πρώτο στην αναγνώριση σήματος από το εξωκυττάριο περιβάλλον, το δε δεύτερο στην επαγωγή υδρολυτικών ενζύμων που διασπούν τα κυτταρικά τοιχώματα του φυτού - ξενιστή. Με στόχο τη λειτουργική μελέτη των ομόλογων των ανωτέρω γονιδίων στην παθογένεια του V. dahliae (εφεξής καλούμενων Vpth και Vrp αντίστοιχα), αξιοποιήθηκαν τεχνικές αντίστροφης γενετικής ανάλυσης, με την πραγματοποίηση προσπαθειών απενεργοποίησης αλλά και υπερέκφρασης των γονιδίων στο μύκητα. Η απενεργοποίηση και στις δύο περιπτώσεις επιχειρήθηκε μέσω γονιδιακής αντικατάστασης, τεχνικής η οποία βασίζεται στον ομόλογο ανασυνδυασμό. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν αλληλόμορφοι αντικατάστασης, στους οποίους η αλληλουχία των γονιδίων διακόπτονταν από γονίδια ανθεκτικότητας σε επιλεγμένα αντιβιοτικά, εν προκειμένω υγρομυκίνη Β στην περίπτωση του Vpth και γενετισίνη στην περίπτωση του Vrp. Παράλληλα, κατασκευάστηκαν και κασέτες επανεισδοχής για την αποκατάσταση των ενδογενών γονιδίων στο γονιδίωμα των μεταλλαγμένων στελεχών. Η απενεργοποίηση του γονιδίου Vpth πραγματοποιήθηκε στο άγριο στέλεχος VdLs.17 (μη – αποφυλλωτικός παθότυπος), ωστόσο η απενεργοποίηση του γονιδίου Vrp στα στελέχη 70V (μη – αποφυλλωτικός παθότυπος) και 22V (T9) (αποφυλλωτικός παθότυπος) που δοκιμάστηκε, δεν ήταν επιτυχής. Όσον αφορά στην υπερέκφραση των γονιδίων, αυτή επιχειρήθηκε, στην περίπτωση του Vpth με έμμεσο τρόπο, εισάγοντας την κατασκευή επανενσωμάτωσης του γονιδίου στο γονιδίωμα αγρίων στελεχών, ενώ στην περίπτωση του Vrp μέσω κατασκευής μιας σύντηξης του γονιδίου με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης EGFP, με τη σύντηξη να τίθεται υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης του Magnaporthe grisea. Και για τα δύο γονίδια τα μεταλλαγμένα στελέχη που αποκτήθηκαν, προέκυψαν από μετασχηματισμό των 70V και 22V (T9) αγρίων στελεχών, μη – αποφυλλωτικού και αποφυλλωτικού παθότυπου αντίστοιχα. Απενεργοποίηση του γονιδίου Vpth περιόρισε τη μυκηλιακή ανάπτυξη, την παραγωγή μικροσκληρωτίων αλλά και την κονιδιοποίηση του μύκητα, ενώ οδήγησε και σε σημαντική μείωση της παθογόνου δράσης του. Εισαγωγή περισσοτέρων ενθεμάτων του Vpth αντίθετα, οδήγησε σε ποικίλο βαθμό αύξησης της έκφρασής του μεταξύ των αποκτηθέντων στελεχών και επέδρασε ποικιλοτρόπως στην παθογένεια. Αντίθετα, υπερέκφραση του γονιδίου Vrp υπό τον έλεγχο ισχυρού υποκινητή, οδήγησε στην απόκτηση μεταλλαγμένων στελεχών με μεγαλύτερη ικανότητα πρόκλησης ασθενείας, συγκριτικά με τα αντίστοιχα άγρια από τα οποία προέκυψαν. Διαφορές παρατηρήθηκαν και ως προς την φαινοτυπική ανάπτυξη αλλά και κονιδιοποίηση των Vrp υπερεκφραζόντων στελεχών, σε υλικά που έφεραν ως πηγή άνθρακα διαφορετικούς μονο- και πολυσακχαρίτες, ενώ η εφαρμογή δοκιμής κατανάλωσης υποστρώματος πηκτίνης υπέδειξε την αυξημένη παραγωγή πηκτινικής λυάσης από τα μεταλλαγμένα στελέχη. Προχωρώντας στο επόμενο σκέλος της εργασίας, επιχειρήθηκε η μελέτη μιας NLP πρωτεΐνης, ονομαζόμενης VdNEP, η παραγωγή της οποίας από το V. dahliae, συμβάλλει στην εκδήλωση των συμπτωμάτων της βερτισιλλίωσης, μέσω της πρόκλησης νέκρωσης και παραγωγής αιθυλενίου. Με απώτερο στόχο, τον εντοπισμό της θέσης δράσης της πρωτεΐνης, κατασκευάστηκε μία σύντηξη του γονιδίου VdNEP με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης EGFP, με όλη την κατασκευή να τίθεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή της ριβοσωμικής πρωτεΐνης του M. grisea. Η σύντηξη εισήχθη στα άγρια στελέχη 25V (SS4), 70V (μη-αποφυλλωτικός παθότυπος) και 22V (T9) (αποφυλλωτικός παθότυπος), με τα μεταλλαγμένα στελέχη που αποκτήθηκαν να μετασχηματίζονται περαιτέρω με το γονίδιο AsRed της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης. Ακόλουθη μελέτη μικροσκοπίας επέτρεψε τον εντοπισμό σε κυτταρικό επίπεδο αλλά πρωτευόντως σε επίπεδο φυτού - ξενιστή, της έκκρισης και διακίνησης της πρωτεΐνης VdNEP. Παράλληλα, διεξήχθη πείραμα προσδιορισμού της έκφρασης του γονιδίου VdNEP αλλά και των υπολοίπων γονιδίων που εξετάστηκαν σε αυτή τη διατριβή, κατόπιν ανάπτυξης των στελεχών 25V (SS4) και 22V (T9) σε συνθήκες που προσομοίαζαν το αγγειακό σύστημα φυτών ξενιστών. Διαφορές καταγράφηκαν όχι μόνο μεταξύ χρονικών στιγμών αλλά και μεταξύ των στελεχών των διαφορετικών παθοτύπων. Τέλος, μελετήθηκε η πιθανότητα αξιοποίησης του γονιδίου VdNEP ως βάσης για την ανάπτυξη ενός μοριακού δείκτη, ο οποίος θα επιτρέπει τον γρήγορο και αποτελεσματικό εντοπισμό των απομονώσεων του παθογόνου που ανήκουν στον ιδιαίτερα καταστρεπτικό αποφυλλωτικό παθότυπο. Για το σκοπό αυτό, κατόπιν αρχικών αποτελεσμάτων υβριδισμών κατά Southern στους οποίους το VdNEP εντοπίστηκε σε διαφορετικά γενωμικά θραύσματα μεταξύ απομονώσεων των δύο παθοτύπων, επιλέχθηκαν να απομονωθούν μέσω Inverse PCR οι περιοχές που συνορεύουν με το γονίδιο σε ποικίλα στελέχη. Σύγκριση των αλληλουχιών επέτρεψε τον εντοπισμό πολυμορφισμών στην 3΄ αμετάφραστη περιοχή (3΄- UTR) του VdNEP μεταξύ των στελεχών αναφοράς για τον αποφυλλωτικό και μη - αποφυλλωτικό παθότυπο. Βάσει αυτών, σχεδιάστηκαν εκκινητές, οι οποίοι αξιολογήθηκαν στη συνέχεια σε ένα εύρος απομονώσεων ως προς την ικανότητά τους να κατηγοριοποιούν τα στελέχη στους αντίστοιχους παθότυπους. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την καταλληλότητα του νέου μοριακού δείκτη ως αξιόπιστου εργαλείου για την διάκριση απομονώσεων του V. dahliae. Δεδομένου του κρίσιμου ρυθμιστικού ρόλου που διαδραματίζουν οι 3΄ αμετάφραστες περιοχές στην σταθερότητα, στον κυτταρικό εντοπισμό και στην τελική μετάφραση των mRNA, ο εντοπισμός των ανωτέρω πολυμορφισμών υποδεικνύει την πιθανή εμπλοκή του γονιδίου στην εμφάνιση του αποφυλλωτικού φαινότυπου και ανοίγει ένα πεδίο που χρήζει περαιτέρω έρευνας.