Study of the function and diversity of the microbial community in plant phyllosphere and rhizosphere and interactions with the environment

Abstract

Phyllosphere and rhizosphere are plant-associated micro-habitats that are known to support diverse microbial communities whose structure is mediated by plants. We aimed to disentangle the mechanisms shaping the microbial communities in the phyllosphere and the soil root zone and identify their response to agricultural practices like soil organic amendment and pesticide application. The focus was on plants indigenous to Mediterranean ecosystems, some of them producing essential oils which are known to exert antimicrobial activities, and also cultivated plants. We initially explored the factors shaping the microbial community of the phyllosphere in plants native to semi-arid Mediterranean ecosystems using q-PCR and amplicon sequencing approaches. We collected leaves at two largely contrasting seasons (summer and winter) from 8 perennial plants with varying attributes, that belong to different functional groups: (i) woody sclerophyllous evergreen, semi-deciduous and non woody shrubs (ii) aromatic and non-aromatic. We determined the abundance of bacteria, Crenarchaea, fungi, Alternaria and Cladosporium (main airborne fungi) via q-PCR, and the structure of the epiphytic bacterial, archaeal and fungal community via amplicon sequencing. We observed strong seasonal effects but no clear plant-host effects on microbial abundance: bacteria showing higher abundance in the winter, and all others in the summer. Plant-host and season were equal determinants of the composition of the bacterial and fungal communities, whereas the archaeal community showed plant-host driven patterns. Plant habit exhibited a stronger filtering effect on the epiphytic microbial communities compared to the aromatic plant nature which affected only the fungal community. The bacterial community was dominated by Chloroflexi and α-proteobacteria in the summer and winter respectively, with OTUs of Sphingomonas, Rhizobia and Methylobacterium favored in the winter. The archaeal community was dominated by the Soil Crenarchaeotic Group (SCG) and Aenigmarchaeota. The fungal community is mostly comprised of Ascomycota with Capnodiales, Pleosporaceae and Dothioraceae being key members whose abundance varied by plant host and season. We extended our study on aromatic plants by exploring their use, as soil amendments. We employed a pot study to examine the impact of peppermint (Menta piperita), spearmint (Menta spicata) and rosemary (Rosemarinus officinalis), in comparison with an organic fertilizer, on the dynamics of key bacterial taxa, Crenarchaea, fungi and functional microbial groups like ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and archaea (AOA), sulfur-oxidizing bacteria (SOB) and catA-, pcaH-carrying bacteria involved in C cycling. We further explored possible interactions between soil amendments and the presence of tomato plant. Soil amendment with peppermint, spearmint and the organic fertilizer increased the abundance of proteobacteria and fungi, in contrast to rosemary, characterized by essential oils with a different chemical profile compared to mints, which benefited these copiotrophic microbial groups only in the presence of tomato plants. We further explored this complex interaction via amplicon sequencing analysis of bacteria, archaea and fungi. This verified the key role of rosemary soil amendment in shaping the bacterial, archaeal and fungal community and its beneficial role in the abundance of proteobacteria. Multivariate analysis identified OTUs belonging to Actinobacteria, mostly associated with undisturbed soil systems (i.e Blastococcus, Rubrobacter, Solirubrobacter, Agromyces) that were negatively affected by rosemary amendment. On the contrary we observed a striking dominance of the cellulose-decomposing basidiomycetes Minimedusa in soils amended with rosemary. The known antibiotic properties of this fungus might explain the negative effects of rosemary soil amendment on Nectriaceae also observed. We finally explored the potential impact of pesticides, as external perturbation factor, on the abundance and diversity of the microbial communities on plant leaves and the soil root zone. We tested the hypothesis that these two habitats support distinct microbial communities but exhibit a similar response (accelerated biodegradation or toxicity) to their repeated exposure to the biodegradable fungicide iprodione. Pepper plants received four repeated foliage or soil applications of iprodione which accelerated its degradation in soil (DT50_1st=1.23 and DT50_4th = 0.48 days) and on plant leaves (DT50_1st >365 and DT50_4th = 5.95 days). The composition of the epiphytic and soil bacterial and fungal communities, determined by amplicon sequencing, were significantly altered by iprodione. The archaeal epiphytic and soil communities responded differently; the former showed no response to iprodione. Three closely related iprodione-degrading Paenarthrobacter strains were isolated from soil and phyllosphere. They hydrolyzed iprodione to 3,5-dichloraniline (3,5-DCA) via the formation of 3,5-dichlorophenyl-carboxiamide and 3,5-dichlorophenylurea-acetate, a pathway shared by other soil-derived arthrobacters implying a phylogenetic specialization in iprodione biotransformation. Overall, we showed that phyllosphere is a habitat colonized by diverse bacteria and fungi, while archaea are less abundant and diverse. The epiphytic microbial community in Mediterranean plants, is shaped by plant-host and seasonality. The use of aromatic plants as soil amendment was found to stimulate copiotrophic microorganisms and microorganisms allelopathic against soil-borne plant pathogens. Finally, we showed that the epiphytic microbiome, responds to pesticide applications, with some microbes became acclimated to degrade pesticides. This thesis has reported the first epiphytic bacterium, a Paenarthrobacter strain, that could degrade iprodione and also suggested an uncommon specialization of Arthrobacter in the degradation of this fungicide.

Η φυλλόσφαιρα και η ριζόσφαιρα είναι μικρο-ενδιαιτήματα του φυτού που είναι γνωστό ότι φέρουν ποικιλόμορφες μικροβιακές κοινότητες, η δομή των οποίων εξαρτάται από το φυτό. Σκοπός μας ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών που διαμορφώνουν τη μικροβιακή κοινότητα της φυλλόσφαιρας και του εδάφους που βρίσκεται περιμετρικά της ρίζας, και η ταυτοποίηση της απόκρισης τους σε καλλιεργητικές πρακτικές, όπως η χρήση εδαφοβελτιωτικών και οι εφαρμογές γεωργικών φαρμάκων. Εστιάσαμε σε γηγενή φυτά του Μεσογειακού συστήματος, μερικά εκ των οποίων παράγουν αιθέρια έλαια που είναι γνωστά για τις αντιμικροβιακές τους ιδιότητες, και επίσης σε καλλιεργούμενα φυτά. Αρχικά διερευνήσαμε τους παράγοντες που διαμορφώνουν τη μικροβιακή κοινότητα της φυλλόσφαιρας γηγενών φυτών του ημιάνυδρου Μεσογειακού οικοσυστήματος, χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις με q-PCR και amplicon sequencing. Συλλέξαμε φύλλα στις δύο εποχές με τις μεγαλύτερες αντιθέσεις (καλοκαίρι και χειμώνας) από 8 πολυετή φυτά με διαφορετικά χαρακτηριστικά που ανήκουν σε διάφορες λειτουργικές ομάδες: (i) αειθαλή ξυλώδη σκληρόφυλλα, φρύγανα και πόες, (ii) αρωματικά και μη-αρωματικά. Καθορίσαμε την αφθονία των βακτηρίων, Κρεναρχαίων, μυκήτων Alternaria και Cladosporium (κύριοι αερομεταφερόμενοι μύκητες) μέσω q-PCR, και τη δομή της επιφυτικής κοινότητας των βακτηρίων, αρχαίων και μυκήτων μέσω amplicon sequencing. Παρατηρήσαμε έντονη επίδραση της εποχής, αλλά όχι ξεκάθαρη επίδραση του φυτού-ξενιστή στη μικροβιακή αφθονία: η βακτηριακή αφθονία ήταν υψηλότερη τον χειμώνα, και η αφθονία όλων των υπόλοιπων μικροοργανισμών ήταν αυξημένη το καλοκαίρι. Φυτό-ξενιστής και εποχή είχαν ίση επίδραση στη σύσταση της μικροβιακής κοινότητας των βακτηρίων και μυκήτων, ενώ η κοινότητα των αρχαίων καθορίζεται από το φυτό-ξενιστή. Το φυτικό είδος αποτελεί σημαντικότερο παράγοντα διαμόρφωσης των επιφυτικών μικροβιακών κοινοτήτων, σε σχέση με την αρωματική φύση των φυτών, η οποία επηρεάζει μόνο τη μυκητιακή κοινότητα. Η βακτηριακή κοινότητα κυριαρχείται από Chloroflexi και α-Πρωτεοβακτήρια το καλοκαίρι και χειμώνα αντίστοιχα, με τα OTUs των Sphingomonas, Rhizobia και Methylobacterium να ευνοούνται τον χειμώνα. Η κοινότητα των αρχαίων κυριαρχείται από Soil Crenarchaeotic Group (SCG) και Aenigmarchaeota. Η μυκητιακή κοινότητα αποτελείται κυρίως από Ascomycota με Capnodiales, Pleosporaceae και Dothioraceae, να είναι τα μέλη-κλειδιά των οποίων η αφθονία διαφοροποιείται αναλόγως του φυτού-ξενιστή και της εποχής. Επεκτείναμε τη μελέτη μας και στα αρωματικά φυτά, εξερευνώντας τη χρήση τους ως εδαφοβελτιωτικά. Πραγματοποιήσαμε ένα πείραμα με γλάστρες, ώστε να μελετήσουμε την επίδραση της μέντας (Menta piperita), του δυόσμου (Menta spicata) και του δενδρολίβανου (Rosemarinus officinalis), σε σύγκριση με ένα οργανικό εδαφοβελτιωτικό, στη δυναμική των κύριων βακτηριακών taxa, Κρεναρχαίων, μυκήτων και άλλων λειτουργικών μικροβιακών ομάδων, όπως τα αμμώνια-οξειδωτικά βακτήρια (AOB) και αρχαία (AOA), τα θείο-οξειδωτικά βακτήρια (SOB) και τα catA-, pcaH- φέροντα βακτήρια, τα οποία εμπλέκονται στον κύκλο του άνθρακα. Επιπλέον διερευνήσαμε πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ εδαφοβελτιωτικών και παρουσίας του φυτού τομάτας. Η βελτίωση του εδάφους με μέντα, δυόσμο και οργανικό εδαφοβελτιωτικό, αύξησε την αφθονία των Πρωτεοβακτηρίων και μυκήτων. Αντίθετα το δενδρολίβανο, το οποίο έχει χαρακτηριστικό αιθέριο έλαιο με διαφορετική σύσταση σε σχέση με τις μέντες έδρασε ευεργετικά στις κοπιοτροφικές αυτές μικροβιακές ομάδες, μόνο κατά την παρουσία του φυτού της τομάτας. Επιπροσθέτως εξερευνήσαμε τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μέσω ανάλυσης amplicon sequencing στις μικροβιακές κοινότητες των βακτηρίων, αρχαίων και μυκήτων. Αυτό επιβεβαίωσε τον ρόλο κλειδί του δενδρολίβανου ως εδαφοβελτιωτικού στη σύσταση της βακτηριακής και μυκητιακής κοινότητας καθώς και αυτής των αρχαίων, αλλά και τον ευεργετικό του ρόλο στην αφθονία των Πρωτεοβακτηρίων. Η εφαρμογή του δενδρολίβανου επηρέασε αρνητικά OTUs που ανήκουν στα Ακτινοβακτήρια, τα οποία σχετίζονται κυρίως με ανέγγιχτα εδαφικά συστήματα (π.χ. Blastococcus, Rubrobacter, Solirubrobacter, Agromyces), όπως προέκυψε από την πολυπαραγοντική ανάλυση. Αντίθετα παρατηρήθηκε μία εντυπωσιακή κυριαρχία των διασπαστών κυτταρίνης βασιδιομυκήτων Minimedusa σε εδάφη εμπλουτισμένα με δενδρολίβανο. Οι γνωστές αντιμικροβιακές ιδιότητες του μύκητα αυτού ίσως να εξηγούν την αρνητική επιρροή του δενδρολίβανου ως εδαφοβελτιωτικού, που παρατηρήθηκε στα Nectriaceae. Τέλος, εξερευνήσαμε την πιθανή επίδραση των γεωργικών φαρμάκων, ως εξωτερικού παράγοντα διαταραχής της αφθονίας και ποικιλότητας των μικροβιακών κοινοτήτων στα φύλλα του φυτού και στο έδαφος στην περιοχή της ρίζας. Εξετάσαμε την υπόθεση ότι αυτά τα δύο ενδιαιτήματα ενώ φέρουν διαφορετικές μικροβιακές κοινότητες, αντιδρούν το ίδιο (επιταχυνόμενη βιοδιάσπαση ή τοξικότητα) στην επαναλαμβανόμενη έκθεση τους στο βιοδιασπώμενο μυκητοκτόνο iprodione. Σε φυτά πιπεριάς εφαρμόστηκαν τέσσερις επαναλαμβανόμενες φυλλικές ή εδαφικές εφαρμογές του iprodione, διαδικασία που επιτάχυνε τη διάσπαση στο έδαφος (DT50_1st=1.23 και DT50_4th = 0.48 ημέρες) και στα φύλλα (DT50_1st >365 και DT50_4th = 5.95 ημέρες). Η σύσταση της επιφυτικής και εδαφικής βακτηριακής και μυκητιακής κοινότητας, η οποία καθορίστηκε με amplicon sequencing, άλλαξε στατιστικώς σημαντικά από το iprodione. Η επιφυτική και εδαφική κοινότητα των αρχαίων αντέδρασε διαφορετικά· με το πρώτο να μην αντιδρά στο iprodione. Τρία συγγενικά στελέχη Paenarthrobacter που διασπούν το iprodione, απομονώθηκαν από έδαφος και φύλλα. Υδρολύουν το iprodione σε 3,5-dichloraniline (3,5-DCA) μέσω σχηματισμού 3,5-dichlorophenyl-carboxiamide και 3,5-dichlorophenylurea-acetate, ένα μονοπάτι που μοιράζονται με άλλα arthrobacters που έχουν απομονωθεί από το έδαφος, προτείνοντας μία φυλογενετική ειδίκευση στη βιομετασχηματισμό του iprodione. Συνολικά, αποδείξαμε πως η φυλλόσφαιρα είναι ένα ενδιαίτημα που αποικίζεται από διαφορετικά βακτήρια και μύκητες, ενώ η αφθονία και ποικιλομορφία των αρχαίων είναι μειωμένη. Η επιφυτική μικροβιακή κοινότητα των Μεσογειακών φυτών διαμορφώνεται από το φυτό-ξενιστή και την εποχή. Η εφαρμογή αρωματικών φυτών ως εδαφοβελτιωτικού βρέθηκε να διεγείρει τους κοπιοτροφικούς μικροοργανισμούς και αλληλοπαθητικούς εναντίων εδαφογενών φυτοπαθογόνων. Τέλος, αποδείξαμε ότι το επιφυτικό μικροβίωμα, αντιδρά στις εφαρμογές γεωργικών φαρμάκων, με μερικά μικρόβια να εγκλιματίζονται στο να διασπούν γεωργικά φάρμακα. Αυτή η διδακτορική διατριβή ανέφερε το πρώτο επιφυτικό βακτήριο, ένα στέλεχος Paenarthrobacter, το οποίο είναι ικανό να διασπά το iprodione και επίσης προτείνει μία μη-κοινή ειδίκευση των Arthrobacter στη διάσπαση αυτού του μυκητοκτόνου.