Development and clinical application of methods for the molecular characterisation of circulating tumour cells (CTCs)

Abstract

Molecular information extracted from circulating tumour cells (CTCs) and circulating tumour DNA(ctDNA), the so-called “liquid biopsy”, offers the possibility to characterise the evolution of a solidtumour in real time and is really helpful for diagnostic and therapeutic purposes. Epigenetic silencing of tumour and metastasis suppressor genes plays a key role in survival and metastatic potential of cancer cells. The aim of the present study was the development and validation of analytical methods for the molecular characterisation of CTCs based on the liquid bead array technology and their application in clinical samples of breast cancer patients. In the present study we developed and evaluated a multiplex PCR-coupled liquid bead array (MLBA) assay for studying simultaneously the expression of the following 14 genes: ALDH1, CD24, CD44, CK19, HER2, hMAM, MAGEA3, PDCD4, PTEN, SNAIL, TWIST, VIM, and PBGD and HPRT as reference genes. The MLBA assay was characterised by high analytical specificity and sensitivity, and reproducibility. The analytical performance of the MLBA assay was compared with a commercially available test (AdnaTest BreastCancer) and our previously established multiplex RT-qPCR assay. The developed assay has the potential to be further expanded in order to include more established targets, e.g.genes correlated with therapy response. We also developed and evaluated a multiplex methylation specific PCR-coupled liquid bead array (MMSPA) assay for detecting simultaneously the promoters methylation status of three tumour and metastasis suppressors, CST6, SOX17 and BRMS1, in CTCs, ctDNA and paired primary breast tumours. The developed assay was characterised by high analytical specificity, sensitivity and reproducibility. The analytical performance of the MMSPA assay was compared with our previously established single qMSP assays. The main principle of the developed methodology has the potential to be extended in a large number of genes-targets and could be applied in many different types of cancer. In the present study, we tried to compare our well established RT-qPCR assay for the detection of CK19 and the protein-based EPISPOT technique for CTCs detection. These two methods gave similar results in terms of samples positivity but cannot be substantially compared in terms of absolute quantification as they represent different detection approaches. A much more essential comparison of the two methods would be the investigation of their correlation in terms of CTC-positivity in patients’ samples.

Η μοριακή ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumour cells, CTCs) και του κυκλοφορούντος καρκινικού DNA (circulating tumour DNA, ctDNA), της επονομαζόμενης «υγρής βιοψίας», παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης της εξέλιξης ενός όγκου σε πραγματικό χρόνο. Η επιγενετική αποσιώπηση ογκοκατασταλτικών και κατασταλτικών της μετάστασης γονιδίων παίζει σημαντικό ρόλο για την επιβίωση και το μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδων για το μοριακό χαρακτηρισμό των CTCs, βασισμένων στην τεχνολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων και η εφαρμογή τους σε κλινικά δείγματα ασθενών με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μεθοδολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων σε συνδυασμό με πολλαπλή RT-PCR (multiplex PCR-coupled liquid bead array, MLBA) για την ταυτόχρονη μελέτη της έκφρασης των ακόλουθων 14 γονιδίων: ALDH1, CD24, CD44, CK19, HER2, hMAM, MAGEA3, PDCD4, PTEN, SNAIL, TWIST, VIM, και PBGD και HPRT ως γονίδια αναφοράς. Η MLBA χαρακτηρίστηκε από υψηλή αναλυτική ειδικότητα, ευαισθησία και αναπαραγωγιμότητα. Η MLBA επίσης συγκρίθηκε με μια εμπορικώς διαθέσιμη δοκιμασία (AdnaTest BreastCancer) και την πολλαπλή RT-qPCR πουαναπτύξαμε στο εργαστήριό μας. Η MLBA θα μπορούσε να επεκταθεί περαιτέρω σε μεγαλύτερο αριθμό γονιδίων-στόχων, π.χ. σε γονίδια που σχετίζονται με την ανταπόκριση στη θεραπεία.Επίσης, αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μεθοδολογία υγρής συστοιχίας σφαιριδίων σε συνδυασμό μεπολλαπλή ειδική για τη μεθυλίωση PCR (multiplex methylation specific PCR-coupled liquid bead array, MMSPA) για την ταυτόχρονη ανίχνευση της μεθυλίωσης των υποκινητών τριών ογκοκατασταλτικών και κατασταλτικών της μετάστασης γονιδίων, CST6, SOX17 και BRMS1, σε δείγματα CTCs, ctDNA και των αντίστοιχων πρωτοπαθών όγκων ασθενών με καρκίνο του μαστού. Η MMSPA χαρακτηρίστηκε από υψηλή αναλυτική ειδικότητα, ευαισθησία και αναπαραγωγιμότητα. Η MSSPA επίσης συγκρίθηκε με τις qMSP που έχουν αναπτυχθεί στο εργαστήριό μας για τον υποκινητή κάθε γονιδίου. Η MMSPA θα μπορούσε να επεκταθεί και σε άλλα γονίδια-στόχους και να εφαρμοστεί και σε άλλους τύπους καρκίνου. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, έγινε επίσης προσπάθεια σύγκρισης της RT-qPCR που έχει αναπτυχθεί στο εργαστήριό μας για την ανίχνευση της CK19 και της τεχνικής EPISPOT, που βασίζεται στην ανίχνευση πρωτεΐνης. Οι δύο μέθοδοι έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα αναφορικώς με τη θετικότητα των δειγμάτων αλλά δεν κατέστη δυνατή η σύγκρισή τους στο επίπεδο της απόλυτης ποσοτικοποίησης, καθώς αντιπροσωπεύουν διαφορετικές προσεγγίσεις. Μια πιο ουσιώδης σύγκριση των 2 μεθόδων θα ήταν η διερεύνηση της συσχέτισής τους ως προς τη θετικότητα δειγμάτων CTCs σε ασθενείς.