Γενετική μελέτη, εξελικτικές σχέσεις και δομική ανάλυση απακετυλασών

Abstract

Polysaccharide deacetylases (PDAs), are members of the carbohydrate esterase family 4 (CE4), acting on polysaccharides, such as chitin and chitosans, peptidoglycans, acetylxylans, and β-1,6-GlcNAc polysaccharides. The CE4 family members share a conserved catalytic core termed the NodB homology domain. Genomes of Bacillus anthracis and its relative Bacillus cereus, both belonging to the B. cereus group of species, contain multigenes of PDAs. In the present thesis, the 3D structures of the putative polysaccharide deacetylases Ba0331 (at 2.59Å resolution) and Ba0330 (at 1.48Å) from the B. anthracis bacterium, the causative agent of the anthrax disease, are presented. In addition the N- acetylglucosamine peptidoglycan deacetylase, Bc1974 (at 1.80Å) from B. cereus bacterium is presented. The structure of six Βc1974 complexes with distinct ligands have also been determined and presented at resolution from 1.45 Å to 3.05Å, which to the best of our knowledge, are the first crystal structures of a peptidoglycan GlcNAc deacetylase in complex with small-molecule ligands.Phylogenetic relationships in the polysaccharide deacetylase gene families of B. anthracis Ames (12 paralogous) and B. cereus ATCC14579 (11 paralogous) were investigated. Separate phylogenetic studies for the two distinct domains of the PDAs were performed for both amino acid and nucleotide sequences. In order to construct a composite phylogenetic tree these data have also been combined with the analysis of PDA genes from other strains of the genus Bacillus. The two paralogous genes of B. anthracis bα0330 and ba0331 were analyzed via specific differences in the gene sequence, protein sequence, and 3D structure of the protein molecules, as well as by their sequence arrangement in the genome, detection of selection in the evolution of gene duplication, and localization patterns available in the literature.The three-dimensional structures of the deacetylases of the two polysaccharide deacetylase genes familes were used for the evolutionary study of the binding site after gene duplication events. The structural comparative analysis of a total of seven (four existing in the literature and three of the present work) structurally determined PDAs of B. anthracis and B. cereus, supports the conclusions of the sequence analysis and demonstrates that, despite the high conservation on the protein sequence, there are distinct differences in the binding site formation, the folding level and the active site assembly. This may indicate that, the binding site forming sequence fragments are under functionally-driven evolutionary pressure in order to accommodate and recognize distinct polysaccharide residues according to cell location, use or environment. This is probably an indication of the distinct roles of PDAs at a cellular level, however it is still an open subject of biochemical verification. Overall, the comparison of the binding cavities among the putative polysaccharide deacetylases of B. anthracis and B. cereus revealed remarkable variation in cavity size and shape, as well as in the amino acid composition of the cavities, indicating elements of divergence in functional characteristics with concurrent conservation of distinct local structural features in the PDA family.

Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών (PDAs) είναι ένζυμα που ανήκουν στις υδατανθρακικές εστεράσες της οικογένειας 4 (CE4) και δρουν σε πολυσακχαρίτες όπως είναι η πεπτιδογλυκάνη, η χιτίνη, η χιτοζάνη, και η ακετυλοξυλάνη. Τα μέλη της CE4 είναι κυρίως μεταλλοεξαρτώμενες υδρολάσες, από ένα ιόν συνήθως Zn2+ ή Co2+. Έχουν μια κοινή καταλυτική δομική ενότητα που ονομάζεται NodΒ.Τα γονιδιώματα των Bacillus cereus, και Bacillus anthracis, δύο συγγενικών ειδών που ανήκουν στην ομάδα B. cereus, έχουν πολλαπλά γονίδια απακετυλάσης πολυσακχαρίτη. Στην παρούσα διατριβή, προσδιορίστηκαν με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ και παρουσιάζονται οι ακόλουθες πρωτεϊνικές δομές: οι φερόμενες απακετυλάσες πολυσακχαρίτη, Ba0331 (διακριτικότητας 2,59Å) και Βa0330 (διακριτικότητας 1,48Å) από το βακτήριο B. anthracis, το οποίο είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της ασθένειας του άνθρακα, καθώς και η απακετυλάση της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης, Bc1974 (διακριτικότητας 1,80Å), του B. cereus. Επίσης προσδιορίστηκαν και παρουσιάζονται οι κρυσταλλικές δομές συμπλόκων της Βc1974 με έξι προσδέτες, διακριτικότητας 1,45 Å έως 3,05Å οι οποίες αποτελούν τις πρώτες δομές συμπλόκων απακετυλάσης της πεπτιδογλυκάνης με μικρά-μόρια προσδέτες. Για τον καθορισμό φυλογενετικών σχέσεων στις οικογένειες γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη του Β. anthracis Ames (12 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) και του B. cereus ATCC14579 (11 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης στο γονιδίωμά του) χρησιμοποιήθηκαν οι αμινοξικές και οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που απαρτίζουν χωριστά τις δομικές ενοτήτες των PDAs. Η απεικόνιση των εξελικτικών γεγονότων στις δύο οικογένειες συνδυάστηκε και με την ανάλυση γονίδιων των PDAs από άλλα στελέχη του γένους Bacillus προκειμένου να ερευνηθούν εξελικτικές σχέσεις των γονιδίων PDAs. Διαδοχικά γεγονότα διπλοποίησης έχουν οδηγήσει σε ομάδες γονιδίων (ή υποοικογένειες) που εμφανίζουν μεταξύ τους μεγαλύτερη ομολογία σε σύγκριση με οποιοδήποτε άλλο γονίδιο εντός της κάθε οικογένειας. Αναλύθηκαν τα δύο παράλογα γονίδια bα0330 και ba0331 του Β. anthracis μέσω συγκεκριμένων διαφορών στην αλληλουχία των γονιδίων, στην αλληλουχία των πρωτεϊνών, στην δομή των πρωτεϊνών, καθώς και μέσω της διάταξής τους στο γονιδίωμα, της ανίχνευσης της δράσης της επιλογής στην εξέλιξη της γονιδιακής διπλοποίησης, και του κυτταρικού εντοπισμού των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους. Οι τρισδιάστατες δομές απακετυλασών της οικογένειας των γονιδίων απακετυλάσης πολυσακχαρίτη χρησιμοποιήθηκαν για την εξελικτική μελέτη της θέσης δέσμευσης μετά από γεγονότα διπλοποίησης. Μέσα από την εργασία αυτή υπογραμμίζεται η σημασία της επίστασης στην εξέλιξη των πρωτεϊνών. Η δομική συγκριτική ανάλυση συνολικά επτά (τεσσάρων υπαρχουσών στη βιβλιογραφία και τριών από την παρούσα εργασία) προσδιορισμένων PDAs των B. anthracis και B. cereus υποστηρίζει τα συμπεράσματα της ανάλυσης αλληλουχίας και καταδεικνύει την ύπαρξη δομικών τροποποιήσεων στον σχηματισμό της θέσης δέσμευσης, παρά την υψηλή συντήρηση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας της και του επίπεδου αναδίπλωσής της. Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι τα τμήματα της αλληλουχίας που σχηματίζουν τη θέση δέσμευσης βρίσκονται υπό εξελικτική πίεση για να φιλοξενήσουν και να αναγνωρίσουν διακριτά κατάλοιπα πολυσακχαριτών ανάλογα με την κυτταρική θέση, τη χρήση ή το περιβάλλον. Εν κατακλείδι, η σύγκριση των κοιλοτήτων δέσμευσης του υποστρώματος μεταξύ των διαφόρων φερόμενων απακετυλασών πολυσακχαρίτη του Β. anthracis και του B. cereus αποκάλυψε αξιοσημείωτη ποικιλότητα ως προς το μέγεθος και το σχήμα της κοιλότητας, καθώς επίσης και ως προς τον τύπο των αμινοξέων που τις συνθέτουν, εντοπίζοντας στοιχεία απόκλισης στα λειτουργικά χαρακτηριστικά με ταυτόχρονη διατήρηση των διακριτών τοπικών δομικών χαρακτηριστικών στην οικογένεια των PDAs.