Μελέτη της έκφρασης της ακουαπορίνης 7 στο λιπώδη ιστό στα παιδιά και διερεύνηση της συμμετοχής της σε μηχανισμούς ανάπτυξης νοσογόνου παχυσαρκίας

Abstract

Childhood obesity constitutes a major healthcare problem worldwide and predisposes to the development of metabolic disorders of the insulin pathway in adipose tissue, even during adolescence. The Protein Kinase B (PKB/Akt2) plays a pivotal role in the insulin induced translocation of the glucose transporter 4 (Glut4) to the plasma membrane for glucose uptake in the adipocyte. AQP7, a water/glycerol transporting protein, regulates adipocyte glycerol efflux and influences lipid and glucose homeostasis. Altered AQP7 expression in adults leads to impaired glycerol dynamics, adipocyte hypertrophy and it predisposes them to obesity and diabetes. Moreover, AQP7 gene promoter variants may lead to impaired transcriptional regulation of AQP7, thus contributing to impaired AQP7- mediated adipocyte glycerol efflux and adipocyte hypertrophy. Metabolically “unhealthy” adipose tissue may indicate impaired HDL lipidation and biogenesis.To assess a possible involvement in the development of childhood obesity and pathological insulin resistance, this study investigated the expression of adipocyte Akt2, Glut4 and AQP7 in cultured adipocytes of lean and obese children and adolescents in relation to serum insulin and glycerol levels. Furthermore, AQP7 promoter was studied, in order to identify possible mutations and/or polymorphisms and to investigate whether they may increase the susceptibility to obesity and metabolic abnormalities.Methods: Genomic DNA was extracted from the blood of 61 lean (BMI<85%) (46 prepubertal, 15 pubertal) and 41 obese (BMI>95%) (22 prepubertal, 19 pubertal) children and adolescents. The samples were sequenced for promoter region -2580 (2421) to -1161 (3840) of AQP7. Primary in vitro differentiated adipocyte cultures of the children were developed from surgical biopsies of subcutaneous abdominal adipose tissue and Akt2, Glut4 and AQP7 mRNA and protein expression was studied by RT-PCR and western immunoblotting, respectively. Fasting serum insulin and glycerol levels were determined by ELISA. Results: Akt2 and p-Akt2 protein expression was decreased in the older lean prepubertal children compared to their younger prepubertal and pubertal lean compatriots (p=0.01). Glut4 protein expression was decreased in the older obese prepubertal children in comparison to the younger obese prepubertal children and the obese adolescents (p=0.049 and p=0.014, respectively). Moreover, it was significantly increased in the obese adolescents in comparison to their respective lean (p=0.01), despite the significant decrease of p-Akt2 (p=0.05). AQP7 mRNA was increased in the younger obese prepubertal children but decreased in the obese adolescents (p=0.014) who also had increased insulin and HOMA-IR. The lean pubertal and the younger obese prepubertal children had increased 41 kDa AQP7 protein expression compared to the younger lean prepubertal children (p=0.001 and p=0.005, respectively). The obese adolescents who expressed the 34 kDa AQP7 had lower triglyceride levels than those who did not express it (p=0.013). In the lean children, triglycerides were negatively correlated with the 34 kDa AQP7 (p=0.033). Insulin was significantly increased in the older lean and obese prepubertal and the lean and obese adolescents compared to the younger lean and obese prepubertal children (p≤0.004). Glycerol was significantly increased in the younger obese prepubertal children in comparison to their lean compatriots (p=0.008) and the older obese prepubertal and pubertal children (obese groups B and C, p=0.001).One novel mutation -2185 (T2816A) was found in an older obese prepubertal child with low AQP7 mRNA expression, high levels of serum glycerol and low serum insulin levels. The novel single nucleotide polymorphisms (SNP) -2291 (A2710G), -2219 (C2782A), -2091 (C2910A) and -1932 (G3069A) were identified, together with the previously described SNP -1884 (C3117T), rs3758268. The haplotype study showed that the recessive haplotype GAAT, for the promoter regions -2291, -2219, -2091 and -1884, was related to lower fasting serum HDL cholesterol levels (p=0.011) and a positive family history of type 2 diabetes (DM2FH) (p=0.001).Conclusions: The lower AQP7 mRNA expression in the obese adolescents, who also have higher Glut4 and lower p-Akt2, thus increased glucose uptake, may reflect a predisposition to adipocyte hypertrophy and metabolic dysfunction, as in the adults, whereas the younger obese prepubertal children may be protected from this. The decreased Glut4 and Akt2 in the older lean prepubertal children together with the increased insulin may contribute to the preparation of this age group for the physiological “insulin resistance” of puberty. The increased 41kDa AQP7 protein expression in the lean adolescents may reflect the increased energy requirements of puberty for glycerol, while in the younger obese prepubertal children, taken together with the decreased insulin and the increased glycerol levels, it may also be protective against the development of adipocyte hypertrophy. The novel mutation -2185 (T2816A) might be associated with the lower gene expression of AQP7 and high levels of serum glycerol, that possibly contribute to the obese phenotype. The novel recessive GAAT haplotype the four SNP -2291(A2710G), -2219(C2782A), -2091(C2910A) and -1884(C3117T) in children and adolescents with low HDL and positive DM2FH may indicate a higher susceptibility of those children of developing ‘metabolically unhealthy’ adipose tissue and DM2 in the future.

Η παιδική παχυσαρκία αποτελεί σημαντικό πρόβλημα παγκοσμίως, καθώς προδιαθέτει στην ανάπτυξη μεταβολικών διαταραχών της σηματοδοτικής οδού της ινσουλίνης στο λιπώδη ιστό, ήδη από την εφηβεία. Η πρωτεϊνική κινάση Β (ΡΚΒ/ Akt2) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ινσουλινο-επαγόμενη μετατόπιση του μεταφορέα γλυκόζης 4 (Glut4) στην πλασματική μεμβράνη για πρόσληψη γλυκόζης από το λιποκύτταρο. Η AQP7, ένας δίαυλος νερού/ γλυκερόλης, ρυθμίζει την έξοδο της γλυκερόλης από τα λιποκύτταρα και επηρεάζει την ομοιοστασία της γλυκόζης και των λιπιδίων. Μεταβολές της έκφρασης της AQP7 στους ενήλικες οδηγούν σε μειωμένη έξοδο γλυκερόλης από τα λιποκύτταρα, με συνεπακόλουθη υπερτροφία και προδιάθεση για εμφάνιση παχυσαρκίας και σακχαρώδη διαβήτη. Επιπλέον, μεταλλάξεις του υποκινητή του γονιδίου της AQP7, πιθανόν, να οδηγούν σε αναστολή της μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου, συμβάλλοντας έτσι σε μειωμένη έξοδο της γλυκερόλης από τα λιποκύτταρα. Ο μεταβολικά "μη υγιής" λιπώδης ιστός, ενδεχομένως, να υποδεικνύει διαταραχές στη βιοσύνθεση της HDL και στο μεταβολισμό των λιπιδίων. Για να διερευνηθεί η πιθανή συμμετοχή σε μηχανισμούς ανάπτυξης παθολογικής αντίστασης στην ινσουλίνη και παιδικής παχυσαρκίας, μελετήθηκε η έκφραση των μορίων Akt2, Glut4 και AQP7 σε ιστοκαλλιέργειες λιποκυττάρων λεπτόσωμων και παχύσαρκων παιδιών και εφήβων σε σχέση με τα επίπεδα νηστείας ινσουλίνης και γλυκερόλης ορού. Επιπλέον, αλληλουχήθηκε ο υποκινητής του γονιδίου της AQP7, προκειμένου να εντοπιστούν πιθανές μεταλλάξεις ή/ και πολυμορφισμοί και να διερευνηθεί κατά πόσον μπορεί να αυτοί να συμβάλλουν στην προδιάθεση για εμφάνιση παχυσαρκίας και των συνοδών μεταβολικών της επιπλοκών.Μεθοδολογία: Το γενωμικό DNA απομονώθηκε από το αίμα 61 (46 προεφηβικών, 15 εφηβικών) λεπτόσωμων (BMI <85%) και 41 (22 προεφηβικών, 19 εφηβικών) παχύσαρκων (BMI> 95%) παιδιών. Τα δείγματα αλληλουχήθηκαν για την περιοχή -2580 (2421) έως -1161 (3840) του υποκινητή του γονιδίου της ΑΟΡ7. Πρωτογενείς in vitro καλλιέργειες πρώιμων και ώριμων λιποκυττάρων των παιδιών αναπτύχθηκαν από χειρουργικές βιοψίες κοιλιακού υποδόριου λιπώδους ιστού. Η μελέτη της γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης των Akt2, Glut4 και AQP7 έγινε με RT-PCR και ανοσοαποτύπωση κατά western, αντίστοιχα. Τα επίπεδα νηστείας ινσουλίνης και γλυκερόλης ορού εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο ELISA.Αποτελέσματα: Η πρωτεϊνική έκφραση των Akt2 και p-Akt2 βρέθηκε μειωμένη στα μεγαλύτερα λεπτόσωμα προεφηβικά παιδιά σε σύγκριση με τα μικρότερα λεπτόσωμα προεφηβικά και τους λεπτόσωμους έφηβους (p=0.01). Η πρωτεϊνική έκφραση του Glut4 ήταν μειωμένη στα μεγαλύτερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά σε σύγκριση με τα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά και τους παχύσαρκους εφήβους (p=0.049 και p=0.014, αντίστοιχα). Επιπλέον, βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στους παχύσαρκους εφήβους σε σύγκριση με τους αντίστοιχους λεπτόσωμους (p =0.01), παρά τη σημαντική μείωση που παρατηρήθηκε στο p-Akt2 (p=0.05). Η έκφραση του mRNA της AQP7 ήταν αυξημένη στα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά, αλλά μειωμένη στους παχύσαρκους έφηβους (p=0.014), οι οποίοι είχαν επίσης αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης νηστείας και HOMA-IR. Οι λεπτόσωμοι έφηβοι και τα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά είχαν αυξημένη πρωτεϊνική έκφραση της 41 kDa ισομορφής της AQP7 (p=0.001 και p=0.005, αντίστοιχα). Τα παχύσαρκα εφηβικά παιδιά που εξέφραζαν την 34 kDa ισομορφή της AQP7 είχαν χαμηλότερα επίπεδα τριγλυκεριδίων από εκείνα που δεν την εξέφραζαν (p=0.013). Στα λεπτόσωμα παιδιά, τα επίπεδα τριγλυκεριδίων παρουσίαζαν αρνητική συσχέτιση με την ισομορφή των 34 kDa (p=0.033). Η ινσουλίνη ήταν σημαντικά αυξημένη στα μεγαλύτερα λεπτόσωμα και παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά και τους λεπτόσωμους και παχύσαρκους εφήβους σε σύγκριση με τα μικρότερα λεπτόσωμα και παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά (p≤0.004). Η γλυκερόλη βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά σε σύγκριση με τα αντίστοιχα λεπτόσωμα (p=0.008) και σε σχέση με τα μεγαλύτερα παχύσαρκα προεφηβικά και εφηβικά παιδιά.Μία πρωτοεμφανιζόμενη μετάλλαξη στη θέση -2185 του υποκινητή (T2816A) εντοπίστηκε σε ένα μεγαλύτερο παχύσαρκο προεφηβικό παιδί, το οποίο επίσης παρουσίαζε μειωμένη mRNA έκφραση AQP7, αυξημένα επίπεδα νηστείας γλυκερόλης ορού και χαμηλά επίπεδα νηστείας ινσουλίνης ορού. Εντοπίστηκαν 4 πρωτοεμφανιζόμενοι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP) στις θέσεις -2291 (Α2710G), -2219 (C2782A), -2091 (C2910A) και -1932 (G3069A) του υποκινητή, μαζί με τον ήδη γνωστό SNP στη θέση -1884 (C3117T), με rs3758268. Η μελέτη των απλότυπων έδειξε ότι ο υπολειπόμενος απλότυπος GAAT, για τις θέσεις -2291, -2219, -2091 και -1884 του υποκινητή, συσχετίστηκε με χαμηλότερα επίπεδα HDL χοληστερόλης ορού (p=0.011) και θετικό οικογενειακό ιστορικό σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 ή διαβήτη κύησης (ΣΔτ2/ΣΔΚ) (p=0.001).Συμπεράσματα: Η χαμηλότερη έκφραση mRNA της AQP7 στα παχύσαρκα εφηβικά παιδιά, τα οποία έχουν επίσης υψηλότερη πρωτεϊνική έκφραση Glut4 και χαμηλότερη έκφραση p-Akt2 και, συνεπώς, αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης, ενδεχομένως, αντικατοπτρίζει την προδιάθεση για υπερτροφία λιποκυττάρων και μεταβολική δυσλειτουργία, όπως στους ενήλικες, ενώ τα μικρότερα παχύσαρκα προεφηβικά παιδιά μπορεί να είναι προστατευμένα από αυτό. Η μειωμένη πρωτεϊνική έκφραση Glut4 και Akt2 στα μεγαλύτερα λεπτόσωμα προεφηβικά παιδιά, μαζί με αυξημένα επίπεδα ινσουλίνης νηστείας ορού, πιθανώς, συμβάλλει στην προετοιμασία αυτής της ηλικιακής ομάδας για τη φυσιολογική "αντίσταση στην ινσουλίνη" της εφηβείας. Η αυξημένη έκφραση της ισομορφής των 41 kDa στα λεπτόσωμα εφηβικά παιδιά, μπορεί να αντικατοπτρίζει τις αυξημένες ενεργειακές ανάγκες της εφηβείας σε γλυκερόλη, ενώ στα μικρότερα λεπτόσωμα προεφηβικά παιδιά, σε συνδυασμό με τη χαμηλά επίπεδα ινσουλίνης και τα αυξημένα επίπεδα γλυκερόλης, μπορεί να είναι προστατευτική έναντι της ανάπτυξης υπερτροφικών λιποκυττάρων.Η πρωτοεμφανιζόμενη μετάλλαξη -2185 (T2816A) μπορεί να σχετίζεται με μειωμένη γονιδιακή έκφραση της AQP7 και υψηλά επίπεδα γλυκερόλης πλάσματος, που, πιθανώς, συμβάλλουν στον παχύσαρκο φαινότυπο. Ο πρωτοεμφανιζόμενος υπολειπόμενος απλότυπος GAAT των 4 SNP στις θέσεις -2291 (A2710G), -2219 (C2782A), -2091 (C2910A) και -1884 (C3117T) σε παιδιά και έφηβους με χαμηλή HDL χοληστερόλη και θετικό οικογενειακό ιστορικό ΣΔτ2/ΣΔΚ μπορεί να σχετίζεται με προδιάθεση για ανάπτυξη μεταβολικά ‘μη υγιούς’ λιπώδους ιστού και ΣΔτ2 στο μέλλον.