Ενδονουκλεάσες – απόπτωση και συγκριτική μελέτη της αντοχής του μη - μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σε δύο σχήματα χημειοθεραπείας με Docetaxel / Cisplatin vs Docetaxel / Gemcitabine

Abstract

During the last years there has been a rapid development in research on the mechanisms of carcinogenesis, aiming to the better understanding of the clinical phenomena observed and to the development of pharmaceutical products with greater efficacy and less toxicity.Normal cell growth is the result of the interplay of three fundamental processes: cell proliferation, cell differentiation and cell death. Cancer is caused by disturbances of these regulatory mechanisms resulting in uncontrolled proliferation of neoplastic cells and the inability to complete the cell differentiation program. Due to these disorders the cells exhibit progressive genomic instability, impaired cell development, and invasion ability. The biological behavior of cancer cells and the host immune responses are responsible for all cancer manifestations.Malignant transformation is caused by the gradual accumulation of multiple mutations in essential genes. These mutations occur for a long time in cells. However, a normal cell selectively acquires the ability to proliferate without control and generates a large number of daughter cells with the same genetic features. The uncontrolled growth and division of cancer cells arises from the gradual acquisition of gene mutations that control cell growth and differentiation or apoptosis. This results in the ability of neoplastic cells to proliferate without physiological limitations. Thus, the pathogenesis of cancer involves three classes of genes. Oncogenes (e.g., ras, EGFR, erb-B, c-kit) are modified forms of normal genes called proto-oncogene that regulate normal cell growth and differentiation. The tumor suppressor genes (e.g., p53, p21,16Summaryretinoblastoma) are genes encoding proteins that inhibit cell proliferation. Finally, DNA repair genes code for proteins whose normal function is to correct errors that arise when cells duplicate their DNA prior to cell division, in order to maintain the genome integrity and DNA replication fidelity.A common target of antitumor drugs widely used as chemotherapeutics in non-small cell lung cancer (NSCLC) is the mechanism of apoptosis. Cell apoptosis or programmed cell death, plays a regulatory and protective role in living organisms as a normal cellular process essential to maintain homeostasis. There are two major pathways of apoptosis in mammalian cells, the extrinsic and intrinsic pathways. The extrinsic pathway is activated via the Fas death receptor (CD95), which is a member of the tumor necrosis factor (TNF) receptor superfamily. When the intrinsic pathway is activated leads to the release of cytochrome-c by the mitochondria. The Bcl-2 family of proteins has an important role in regulating the intrinsic pathway of apoptosis. Both pathways result in a final common pathway involved in the activation of a cascade of proteases called caspases, resulting in the programmed cell death.The p53 gene, the NFκB factor and the PI3K kinase play an important role in the regulation of apoptosis. p53 gene is located in the short arm of chromosome 17 and its protein product is present in almost all normal tissues. In normal cells, p53 regulates cell division. In particular, in response to DNA damage, its levels increase and prevent the cell from entering S phase of the cell cycle, thus providing enough time for DNA repair to take place. Thus, p53 acts by limiting uncontrolled cell proliferation. Loss of p53 leads to inhibition of apoptosis.17SummaryThe aim of this study was to investigate the molecular and histopathological parameters that determine the resistance of NSCLC to different chemotherapeutic regimens. The study initially focused on endonucleases (enzymes involved in repairing DNA damage) and on proteins that control apoptosis (p53, p21, bcl-2).A total of 131 consecutive patients with histologically confirmed stage ΙΙΙB-IV NSCLC were enrolled. Patients received first-line chemotherapy combinations with docetaxel-gemcitabine or docetaxel-cisplatin at the «Sotiria» Hospital of Chest Diseases of Athens. The study has been approved by the institutional ethics committee and all patients gave their informed consent for the use of the tissue material for translational research. Patient data have not been used or presented in another study.The first results of the study were not encouraging, as the analysis in the first 100 patients failed to reveal statistically significant differences between groups of patients based on endonuclease (APE1) detection but also on the p53, p21 and bcl-2 proteins that are involved in the process of apoptosis.Due to the above difficulties, we evaluated the correlation of BRCA1, TXR1 and TSP1 mRNA expression with treatment outcome to docetaxel-based first-line chemotherapy in patients with stage IIIB-IV NSCLC.The BRCA1 protein is involved in DNA repair and the gene product has been associated with various tumors, including NSCLC. The BRCA1 expression is associated with sensitivity to taxane therapy and platinum resistance. TXR1 is also associated with taxane resistance by inhibiting the process of apoptosis in the cells. This activity is mediated by the transcriptional repression of thrombospondin 1 (TSP1) expression.18SummaryOur results have shown that TXR1-TSP1 mRNA levels were inversely correlated with the treatment outcome (Spearman's test: -0.37; p = 0.001), ie lower levels of TXR1 mRNA showed statistically significant correlation with higher response rates (RR; p = 0.018), higher median progression-free survival (PFS, p = 0.029) and higher mean overall survival (mOS p = 0.003). In contrast, high levels of TSP1 mRNA expression were associated with higher response rates (p = 0.035), higher PFS (p <0.001), and higher mean overall survival (p <0.001). Additionally, higher BRCA1 mRNA gene expression was significantly associated with higher response rates (p = 0.028) and elevated PFS (p = 0.021), but not with higher mean overall survival (p = 0.4). Multifactorial analysis showed that the combination of low levels of TXR1 / high TSP1 mRNA was an independent factor predicting increased PFS (HR 0.49; 95% CI: 0.32-0.76; p <0.001) and mean overall survival (HR 0.37; 95% CI: 0.2-0.58; p<0.001). The same analysis revealed that increased BRCA1 mRNA gene expression was associated with elevated PFS (HR 0.53; 95% CI: 0.37-0.78; p = 0.001).These results indicated that the expression of TXR1-TSP1 and BRCA1 can be used as predictive marker of the NSCLC patients’ response to taxane chemotherapy.

Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται ραγδαία εξέλιξη στην ερευνητική δραστηριότητα πάνω στους μηχανισμούς της καρκινογένεσης με στόχο τόσο την πληρέστερη κατανόηση των κλινικών φαινομένων που παρατηρούνται, όσο και στην ανάπτυξη φαρμακευτικών παραγόντων με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα καθώς και μικρότερη τοξικότητα.Η φυσιολογική ανάπτυξη των κυττάρων είναι αποτέλεσμα της αρμονικής συνεργασίας τριών βασικών διαδικασιών : του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της κυτταρικής διαφοροποίησης και του κυτταρικού θανάτου. Ο καρκίνος προκαλείται από διαταραχή των ρυθμιστικών μηχανισμών των παραπάνω διαδικασιών με αποτέλεσμα τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων και ταυτόχρονα την αδυναμία ολοκλήρωσης του προγράμματος κυτταρικής διαφοροποίησης. Λόγω των βασικών αυτών διαταραχών τα κύτταρα εμφανίζουν προϊούσα γονιδιακή αστάθεια, αδυναμία φυσιολογικής γήρανσης και αποκτούν ικανότητα διήθησης στους γειτονικούς ιστούς. Η βιολογική συμπεριφορά των τροποποιημένων αυτών κυττάρων και η αντίδραση του ξενιστού είναι υπεύθυνες για το σύνολο των εκδηλώσεων του καρκίνου.Η κακοήθης εξαλλαγή, σύμφωνα με τα υπάρχοντα δεδομένα, οφείλεται σε σταδιακή συσσώρευση πολλαπλών αλλοιώσεων σε κρίσιμα γονίδια του κυττάρου. Οι αλλοιώσεις αυτές επισυμβαίνουν διαδοχικά για μακρύ χρονικό διάστημα στα κύτταρα αλλά επιλεκτικά ένα συνηθισμένο κύτταρο αποκτά ικανότητα ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού και δημιουργεί μεγάλο αριθμό θυγατρικών κυττάρων με τα ίδια γενετικά χαρακτηριστικά. Η ανεξέλεγκτη11Περίληψηαύξηση των καρκινικών κυττάρων προέρχεται από τη σταδιακή απόκτηση μεταλλάξεων στα γονίδια που ελέγχουν την κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση ή που ελέγχουν την απόπτωση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ικανότητα των νεοπλασματικών κυττάρων να πολλαπλασιάζονται χωρίς τους φυσιολογικούς περιορισμούς. Έτσι, στην παθογένεια του καρκίνου εμπλέκονται τρεις κατηγορίες γονιδίων. Τα ογκογονίδια (π.χ. ras, EGFR, erb‐B, c‐kit) είναι τροποποιημένες μορφές των φυσιολογικών γονιδίων που ονομάζονται πρωτογκογονίδια και ρυθμίζουν τη φυσιολογική κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση. Τα ογκοκατασταλτικά γονίδια (π.χ. p53, p21, retinoblastoma) είναι γονίδια των οποίων τα προϊόντα αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τέλος, τα μεταλλαγμένα γονίδια εμπλέκονται στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA με στόχο να διατηρούν την ακεραιότητα του γονιδιώματος και την πιστότητα της αντιγραφής του DNA.Ένας πολύ συχνός στόχος των αντινεοπλασματικών φαρμάκων που χρησιμοποιούνται ευρέως ως χημειοθεραπευτικά στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Non Small Cell Lung Cancer - NSCLC) είναι ο μηχανισμός της απόπτωσης. Η κυτταρική απόπτωση, ή αλλιώς προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, παίζει ρυθμιστικό και προστατευτικό ρόλο στους ζώντες οργανισμούς ως μια φυσιολογική κυτταρική διαδικασία απαραίτητη για τη διατήρηση της ομοιόστασης. Αναγνωρίζονται δύο βασικά μονοπάτια δια μέσου των οποίων το κύτταρο οδηγείται σε θάνατο στα πλαίσια της απόπτωσης. Το πρώτο (εξωγενές ή κυτταροπλασματικό ή εξαρτώμενο από τους υποδοχείς θανάτου) ενεργοποιείται διαμέσου του υποδοχέα θανάτου Fas (CD95), ο οποίος είναι μέλος της υπερ-οικογένειας υποδοχέων του TNF (Tumor Necrosis Factor - παράγοντας νέκρωσης όγκων). Το12Περίληψηδεύτερο μονοπάτι (ενδογενές ή μιτοχονδριακό) ενεργοποιούμενο, οδηγεί στην αποδέσμευση του κυτοχρώματος-c από τα μιτοχόνδρια. Η οικογένεια πρωτεϊνών Bcl-2, κατέχει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του ενδογενούς μονοπατιού της απόπτωσης. Τόσο το πρώτο όσο και το δεύτερο μονοπάτι καταλήγουν σε ένα τελικό κοινό μονοπάτι που εμπλέκεται στην ενεργοποίηση ενός καταρράκτη πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες με τελικό αποτέλεσμα τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο.Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης κατέχουν το γονίδιο p53, ο παράγοντας NFκB και η κινάση PI3K. Το γονίδιο p53 βρίσκεται στο βραχύ σκέλος του χρωμοσώματος 17 και το πρωτεϊνικό του προϊόν είναι παρόν σε όλους σχεδόν τους φυσιολογικούς ιστούς. Στα φυσιολογικά κύτταρα το p53 ρυθμίζει την κυτταρική διαίρεση. Συγκεκριμένα, σε αντίδραση στη βλάβη του DNA, τα επίπεδά του αυξάνουν και εμποδίζουν το κύτταρο να εισέλθει στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, παρέχοντας έτσι αρκετό χρόνο ώστε να πραγματοποιηθεί η διόρθωση του DNA. Mε αυτόν τον τρόπο, το p53 δρα περιορίζοντας τον ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η απώλεια του p53 οδηγεί σε αναστολή της απόπτωσης.Σκοπός του ερευνητικού έργου είναι η διερεύνηση των μοριακών και ιστοπαθολογικών παραμέτρων που καθορίζουν την αντοχή του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα σε διαφορετικά χημειοθεραπευτικά σχήματα. Η μελέτη αρχικά εστίασε στις ενδονουκλεάσες (ένζυμα που ενέχονται στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA) και στις πρωτεΐνες που ελέγχουν τη διαδικασία της απόπτωσης (p53, p21, Βcl-2).Καταγράφηκαν 131 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα σταδίου ΙΙΙΒ-IV. Οι ασθενείς έλαβαν13Περίληψηχημειοθεραπευτικούς συνδυασμούς 1ης γραμμής με δοσεταξέλη-γεμσιταμπίνη ή δοσεταξέλη-σισπλατίνη στο Γενικό Νοσοκομείο Νοσημάτων Θώρακος Αθηνών «Σωτηρία» και στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Ηρακλείου (ΠΑΓΝΗ). Όλοι οι ασθενείς αποδέχτηκαν το βιοπτικό υλικό του όγκου να χρησιμοποιηθεί για μοριακό και ανοσοϊστοχημικό έλεγχο χωρίς επιβάρυνσή τους ή του νοσοκομείου. Η μελέτη έχει πάρει την έγκριση της επιστημονικής επιτροπής Ηθικής και Δεοντολογίας του νοσοκομείου. Τα στοιχεία των ασθενών δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ή παρουσιαστεί σε άλλη μελέτη.Τα πρώτα αποτελέσματα της μελέτης δεν ήταν ενθαρρυντικά, καθώς οι αναλύσεις στους πρώτους ασθενείς δεν κατάφεραν να αναδείξουν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις ομάδες των ασθενών με βάση τον εντοπισμό ενδονουκλεασών αλλά και των πρωτεϊνών p53, p21, Βcl-2 που συμμετέχουν στη διαδικασία της απόπτωσης.Λόγω των παραπάνω δυσκολιών, προχωρήσαμε στην εκτίμηση της συσχέτισης της έκφρασης των mRNA των BRCA1, TXR1 και TSP1 με την έκβαση της θεραπείας των ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σταδίου IIIΒ-IV με χημειοθεραπεία 1ης γραμμής που περιελάμβανε δοσεταξέλη.Η πρωτεΐνη BRCA1 συμμετέχει στην επιδιόρθωση του DNA και το προϊόν του γονιδίου έχει συσχετιστεί με διάφορους καρκινικούς όγκους, μεταξύ των οποίων και ο NSCLC. Συγκεκριμένα, η έκφραση της BRCA1 συνδέεται με ευαισθησία στη θεραπεία με ταξάνες και αντοχή στην πλατίνα. Το γονίδιο TXR1 σχετίζεται επίσης με την αντίσταση στις ταξάνες, αναστέλλοντας τη διαδικασία της απόπτωσης στα κύτταρα. Η δράση του αυτή διαμεσολαβείται14Περίληψηαπό την καταστολή, σε μεταγραφικό επίπεδο της έκφρασης της θρομβοσπονδίνης (TSP1).Τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης έδειξαν ότι τα επίπεδα των mRNA των TXR1-TSP1 συσχετίζονται αντίστροφα με την έκβαση της θεραπείας (Spearman’s test: -0.37; p=0.001), δηλαδή χαμηλότερα επίπεδα TXR1 mRNA παρουσίαζαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με υψηλότερα ποσοστά ανταπόκρισης (RR; p=0.018), μεγαλύτερο ελεύθερο νόσου διάστημα (PFS; p=0.029) και υψηλότερη μέση συνολική επιβίωση (mOS p=0.003). Αντίθετα, υψηλά επίπεδα έκφρασης TSP1 συσχετίστηκαν με υψηλότερα ποσοστά ανταπόκρισης (p=0.035), μεγαλύτερο PFS (p<0.001) και υψηλότερη μέση συνολική επιβίωση (p < 0.001). Επίσης, υψηλότερη έκφραση του BRCA1 mRNA συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλότερα ποσοστά ανταπόκρισης (p=0.028) και αυξημένο PFS (p=0.021), αλλά όχι ανάλογη αύξηση της μέσης συνολικής επιβίωσης (p=0.4). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι ο συνδυασμός χαμηλών επιπέδων mRNA TXR1 / υψηλών TSP1 αποτελεί έναν ανεξάρτητο παράγοντα που προβλέπει αυξημένο PFS (HR 0.49; 95% CI: 0.32-0.76; p<0.001) και μέση συνολική επιβίωση (HR 0.37; 95% CI: 0.2-0.58; p<0.001). Από την ίδια ανάλυση προκύπτει ότι η αυξημένη έκφραση BRCA1 σχετίζεται με αυξημένο PFS (HR 0.53; 95% CI: 0.37-0.78; p=0.001).Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η έκφραση των TXR1-TSP1 και BRCA1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προβλεπτικός παράγοντας για την ανταπόκριση των ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα στη χημειοθεραπεία με ταξάνες.