Ο ρόλος των ιόντων σιδήρου ατη μεταγωγή του σήματος σε κύτταρα τα οποία έχουν εκτεθεί σε οξειδωτικό στρές

Abstract

Iron (Fe) is an essential element for a variety of important biological processes.The ability of iron to exist in various oxidation states makes it an essential element inmany cellular processes associated with basic physiological cell functions. On theother hand, the same high redox potential that enables iron to readily switch betweenthe ferrous and ferric states also makes it potentially toxic. Although, iron is usuallybound with high affinity to specialized proteins in order to abrogate the deleteriouseffects of free iron during oxidative stress, a distinct minor fraction of total cellulariron is thought to be loosely bound to diverse intracellular ligants and serves as acrossroad of cell iron metabolism. This fraction of iron is called redox-active iron andin the presence of H2O2, it catalyzes the generation of the extremely reactive hydroxylradical (HO.), which rapidly react and oxidize the cellular components.Recent studies of our research group have shown that redox active iron appearsto be essential for the signal transduction. Redox active iron is specifically responsiblefor the sustained activation of the MAP kinase JNK/p38 axis, which is critical forapoptotic cell death. In this study, we further investigated the role of redox active ironin Η2Ο2 induced signaling. Furthermore, we investigated the role of Trx1 and Grx1 onthe phosphorylation of the three MAP kinases (JNK, p38, ERK) phosphorylationunder oxidative stress conditions. For this purpose, we preincubated H1299 cell line(human pulmonary cancer cells) with a specific iron chelator desferioxamine (DFO)and then challenged with Η2Ο2. DFO represents a strong iron chelator, which is takenup by fluid phase endocytosis, reaching the lysosomal compartment. Iron depletion byDFO attenuated the second prolonged phases of JNK and p38, but had slight effect onERK phosphorylation, which is regulated cell survival and proliferation.Next we tested the role of Trx1 and Grx1, which involved in maintenance ofintracellular redox homeostasis, on MAP kinases phosphorylation. For this purpose,Trx1 and Grx1 were stably overexpressed or silenced in the same H1299 cell line. Upon Η2Ο2 treatment, overexpression of Trx1 reduced the sustained phosphorylationof JNK and the two phosphorylation phases of p38. On the other hand, overexpressionof Grx1 reduced the sustained phosphorylation of JNK and mainly the sustainedphosporylation of p38. In addition, downregulation of Trx1 promoted the sustainedphosphorylation of JNK and the two phosphorylation phases of p38 upon Η2Ο2 challenge. On the contrary, downregulation of Grx1 increased mainly the prolongedphases of JNK and p38 phosphorylation. Interestingly, overexpression/silencing ofTrx1 and Grx1 respectively, had no effect on ERK phosphorylation.The phosphorylation levels of MAP kinases depend on upstream kinasesMAPKK and MAPKKK. It is proposed that ASK1, a special MAPKKK, isresponsible for the phosphorylation of JNK and p38. After cell exposure to Η2Ο2, itwas observed two phases of disulfide bond formation of this kinase. The oxidation ofcysteine residues in ASK1 resulting at the formation of disulfide bonds among ASK1molecules or other proteins. Afterwards, the role of labile iron in Η2Ο2- inducedoxidation of ASK1 was investigated. Interestingly, the second phase of ASK1oxidation was attenuated by DFO, implicating labile iron in ASK1 oxidation.In conclusion intracellular labile iron, Trx1 and Grx1 have a more specific rolein Η2Ο2 induced apoptosis. However, the precise role of these molecules has to beelucidated.

Ο σίδηρος (Fe) αποτελεί ένα σημαντικό στοιχείο καθώς εμπλέκεται σε μεγάλοαριθμό κυτταρικών λειτουργιών. Η ιδιότητα των ιόντων σιδήρου να μεταβάλλουν τηνοξειδοαναγωγική τους κατάσταση τους προσδίδει αφενός μία προνομιακή θέση στηζώσα ύλη, αφετέρου τα καθιστά πιθανές πηγές κινδύνου. Εντούτοις, στοκυτταρόπλασμα υπάρχει μια μικρή ποσότητα σιδήρου που είναι δεσμευμένη με μικρήσυγγένεια σε διάφορα ενδοκυττάρια μόρια και είναι άμεσα διαθέσιμη στο κύτταρογια την κάλυψη των αναγκών του. Το μέρος αυτό του σιδήρου καλείται«οξειδοαναγωγικά ενεργός σίδηρος» (Labile Iron Pool, LIP), καθώς είναι ικανό νααντιδρά με Η2Ο2, με συνέπεια τη δημιουργία των εξαιρετικά δραστικών ριζώνυδροξυλίου (.ΟΗ), οι οποίες όταν σχηματισθούν αντιδρούν ακαριαία, οξειδώνονταςτα κυτταρικά συστατικά.Πρόσφατες μελέτες της εργαστηριακής μας ομάδας, έδειξαν ότι τα καταλυτικάενεργά ιόντα σιδήρου εμπλέκονται στην κυτταρική σηματοδότηση. Πιοσυγκεκριμένα, εμπλέκονται στην παρατεταμένη φωσφορυλίωση και ενεργοποίησητων ΜΑΡ κινασών, JNK και p38 η οποία σχετίζεται με τον προγραμματισμένοκυτταρικό θάνατο. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε διεξοδικά ο ρόλος τωνιόντων σιδήρου και των πρωτεϊνών θειορεδοξίνη 1 (Trx1) και γλουταρεδοξίνη 1(Trx1) στην επαγωγή της απόπτωσης από το Η2Ο2. Η δέσμευση του ενδοκυττάριουσιδήρου έγινε με τη χρήση της ισχυρής σιδηροδεσμευτικής ένωσης δεσφεριοξαμίνης(DFO) η οποία εισέρχεται στα κύτταρα με ενδοκύττωση υγρής φάσης και μέσω τωνενδοσωματίων καταλήγει στα λυσοσωμάτια. Για την εκτέλεση των πειραμάτωνχρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Η1299 (ανθρώπινα καρκινικά κύτταραπνεύμονα). Διαπιστώθηκε ότι η δέσμευση των ιόντων σιδήρου ανέστειλε τηνπαρατεταμένη φωσφορυλίωση των JNK και p38 που προκαλείται μετά από τηνέκθεση των κυττάρων σε οξειδωτικό στρες υπό τη μορφή του Η2Ο2. Αντιθέτως, δενεπηρέασε ή επηρέασε σε μικρό βαθμό τη φωσφορυλίωση της ERK, μιας κινάσης ηοποία ρυθμίζει άλλες κυτταρικές διεργασίες, όπως η επιβίωση και οπολλαπλασιασμός.Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, ελέγχθηκαν οι επιπτώσεις τηςΤrx1 και της Grx1, δυο βασικών ρυθμιστών της οξειδοαναγωγικής ισσοροπίας των κυττάρων στην ενεργοποίηση των ΜΑP κινασών. Για το σκοπό αυτόδημιουργήθηκαν 4 διαφορετικές σταθερές κυτταρικές σειρές Η1299, οι οποίες είτευπερεκφράζουν είτε υποεκφράζουν κάθε μια από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Ότανοι σειρές αυτές εκτέθηκαν σε Η2Ο2 παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση της Trx1,ανέστειλε τη φωσφορυλίωση τόσο της JNK όσο και των δύο φάσεων της p38.Αντίθετα, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση της Grx1 ανέστειλε τη φωσφορυλίωσητης JNK αλλά μόνο τη δεύτερη φάση φωσφορυλίωσης της p38, χωρίς να επηρεάζειτην πρώτη φάση. Ωστόσο, η υπερέκφραση των Trx1 και Grx1 δεν επηρέασε ταεπίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Από την άλληπλευρά η υποέκφραση και των δύο αυτών πρωτεϊνών προκάλεσε την αυξημένηφωσφορυλίωση της JNK μετά από έκθεση των κυττάρων σε Η2Ο2. Όσον αφορά τηνp38, η υποέκφραση της Trx1 ενίσχυε και τις δύο φάσεις φωσφορυλίωσής της, σεαντίθεση με την Grx1 που ενίσχυε μόνο τη δεύτερη, αλλά όχι την πρώτη. Τέλος, ηαποσιώπηση των εν λόγω πρωτεϊνών δεν επηρέασε την επαγωγή της φωσφορυλίωσηςτης ERK.Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης των ΜAP κινασών εξαρτώνται από ανοδικέςκινάσες, τις ΜAPKK και αυτές με τη σειρά τους από τις MAPKKK. Υπεύθυνη για τηφωσφορυλίωση των JNK και p38 έχει προταθεί ότι είναι μια ειδική MAPKKK, ηASK1. Μετά από έκθεση των κυττάρων σε Η2Ο2 παρατηρήθηκαν δύο φάσειςσχηματισμού δισουλφιδικών δεσμών της εν λόγω κινάσης. Κυστεϊνικά κατάλοιπαστην ASK1 οξειδώνονται δημιουργώντας δισουλφιδικό(ούς) δεσμό(ούς) είτε με έναάλλο μόριο ASK1 (διμερή) είτε με άλλες πρωτεΐνες. Εν συνεχεία ελέγχθηκε ο ρόλοςτων ιόντων σιδήρου στην οξείδωση της ASK1. Διαπιστώθηκε ότι η δέσμευση τωνιόντων σιδήρου ανέστειλε κυρίως τη δεύτερη φάση οξείδωσης της ASK1. Συμπερασματικά, από την παρούσα εργασία, προκύπτει ότι τα ιόντα σιδήρου καθώς και οι πρωτεΐνες Trx1 και Grx1, έχουν εξειδικευμένους ρόλους και εμπλέκονται στη διαδικασία της απόπτωσης που προκαλείται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Ωστόσο, ο ακριβής προσδιορισμός του μοριακού μηχανισμούχρήζει περαιτέρω διερεύνησης.