Επίδραση ενδο-συμβιωτικών μικροοργανισμών στη συμπεριφορά και βιολογία της μύγας της Μεσογείου (Diptera: Tephritidae)

Abstract

Inasmuch the role of endosymbiotic bacteria on the biology and the sexual behavior of Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) remains rather unexplored, we initiated this doctorate dissertation with a twofold aim: i) to elucidate the effects of the bacterium Wolbachia on important medfly life history traits, and ii) to explore the possibility of using Wolbachia and gut microbiota as a useful component in medfly mass-rearing production and operational population suppression programs (via the exploitation of Wolbachia-induced reproductive incompatibility phenomena, and the possible probiotic effects of Enterobacter sp., respectively). In the first series of experiments, we studied the effects of Wolbachia infection on fundamental biolological and behavioral traits of medfly, under laboratory conditions. Flies used in the experiments were obtained from small-scale, laboratory reared, medfly colonies. Experiments, were conducted in the Laboratory of Entomology and Agricultural Zoology, University of Thessaly.The results showed that Wolbachia infection: a) did not affect neither the progress of sexual maturity of females nor the number of mature eggs in their ovaries, in none of the two adult diets, b) reduced males sexual signaling rates. The negative effect was more pronounced on the males fed on the protein rich diet compared with those fed only sugar. Moreover, using sexual signaling as an indicator of the males’ progress of sexual maturity, our results revealed that Wolbachia infection delayed males’ sexual maturity, in both diets, c) dramatically reduced males’ mating competitiveness in small cages (400 cm3), and d) did not affect sperm storage in females’ spermathecae. In the same experimental section, we investigated: i) medfly females’ mating and remating receptivity, and ii) females’ demographic traits. Briefly, the results showed that: a) Wolbachia infection modified the probability of mating and remating, b) females’ infection with Wolbachia boosted egg production. Although, males’ infection did not affect significantly the egg production, we recorded the tendency of the uninfected females to oviposite more eggs when their first mating partner was an uninfected male. The number of females’ copulas (one or two) did not affect egg production, c) females’ Wolbachia infection dramatically reduced egg hatching rates. Moreover, the sperm of infected males seems to outcompete the sperm of uninfected males, when both are present in females’ spermathecae, and d) Wolbachia infection increased the longevity of the remated females, whereas did not affect the longevity of the once mated females. Interestingly, remating induced a significant cost on the survival of the uninfected females but not on the survival of Wolbachia infected females. On the contrary, the remated, infected, females lived longer than the once mated, infected, females. The males’ infection did not affect females’ survival. In another series of experiments (Chapters 3, 4), we evaluated the potential of using symbiotic bacteria (Wolbachia, gut microbiota) to improve the mass-rearing production of medflies. Experiments were conducted in FAO/IAEA Insect Pest Control Laboratory (IPCL), Seibersdorf, Austria during 2013-2014. Flies used in the experiments were reared under small-scale mass-rearing conditions. We studied the effects of Wolbachia infection in fundamental fitness parameters of medfly and the probiotic role of Enterobacter sp. when the bacteria were used as dietary supplement to the larval diet, under the standard operating procedures used in Sterile Insect Technique (SIT) operational programs. The findings suggest that Wolbachia infection has significant impact on several medfly fitness parameters under mass-rearing production. The reduction of the fertility rates, which is also reflected on the lower adult recovery rates, was the more pronounced effect whereas shortening of the pre-pupa duration of GSS medfly strain was also recorded. Neither wCer2 nor wCer4 had significant effects on lifespan and fecundity of the adult medflies. No effects were observed on sex ratio determination. Regarding males’ mating competitiveness ability, it is determined not only by the host genetic background but also by the Wolbachia strain (genotype x genotype interactions). Finally, we showed that the “quality” of the flies, as reflected by the flight ability index used is also a combined affair of medfly genetic background and Wolbachia strain, whereas the ability to survive under stress conditions has not to do with the bacterial infection but only with medfly genomic background. The investigation of medfly’s gut microbiota showed can be summarized as follows: a) a culture-dependent approach, using larval and adult (male and female) guts, resulted in the isolation of three bacterial species (Providencia sp., Enterobacter sp., and Acinetobacter sp.), (b) larval diet-based probiotic application of Enterobacter sp., in particular as “live bacteria”, resulted in improved pupal and adult productivity, as well as faster development, particularly of males, and (c) there was no effect on weight, sex ratio, male mating competitiveness, flight ability and the adults’ ability to survive under stress conditions. The results of the current thesis contribute to a thorough knowledge of the biological and behavioral alterations induced by Wolbachia in Ceratitis capitata. Considering the constraints arise from the mass-rearing conditions, we also evaluated the effects of Wolbachia infection and the probiotic role of Enterobacter sp. on medfly, according to the standard quality control guidelines used in insect mass-rearing facilities. The information collected here could be a first step in a trial to investigative whether symbiotic bacteria (Wolbachia, gut bacteria) could be a reliable contributor in SIT programs in terms of the agricultural pest control needs. The Wolbachia and gut bacteria prospect of contribution towards insect field population control are being discussed and possibilities for future research are being proposed.

Μελετήθηκε η επίδραση του ενδοκυτταρικού βακτηρίου Wolbachia pipientis σε βασικές παραμέτρους της ζωής της μύγας της Μεσογείου, Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae), καταγράφηκε η σύσταση της βακτηριακής κοινότητας του πεπτικού της συστήματος και μελετήθηκε η προβιοτική δράση του απομονωθέντος βακτηριακού είδους Enterobacter sp. στη φυλή Vienna 8 GSS του εντόμου, η οποία εκτρέφεται μαζικά για την κάλυψη των αναγκών των προγραμμάτων εξαπόλυσης στειρωμένων εντόμων (Sterile Insect Technique). Στην πρώτη ενότητα πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Εντομολογίας και Γεωργικής Ζωολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας μελετήθηκαν σε εργαστηριακές συνθήκες και με έντομα αποικιών που εκτρέφονταν σε μικρούς πληθυσμούς, βασικές βιολογικές και συμπεριφορικές προσαρμογές του εντόμου συνεπεία της βακτηριακής μόλυνσης με Wolbachia. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μόλυνση με Wolbachia: α) δεν επηρέασε την πρόοδο της αναπαραγωγικής ωρίμανσης των θηλυκών ούτε το συνολικό αριθμό ώριμων αυγών στις ωοθήκες τους, τόσο εκείνων που τράφηκαν στο στάδιο του ενηλίκου με υδρολυμένη μαγιά και ζάχαρη όσο και εκείνων που τράφηκαν μόνο με ζάχαρη, β) μείωσε τη συχνότητα του σεξουαλικού καλέσματος των αρσενικών της μύγας της Μεσογείου. Η αρνητική επίδραση της μόλυνσης με Wolbachia ήταν εντονότερη στα αρσενικά που είχαν πρόσβαση σε πρωτεΐνη (υδρολυμένη μαγιά) σε σχέση με τα αρσενικά που τρέφονταν αποκλειστικά με ζάχαρη. Επίσης, η εκδήλωση του σεξουαλικού καλέσματος ως ένδειξη της ταχύτητας αναπαραγωγικής ωρίμανσης των αρσενικών έδειξε ότι η βακτηριακή μόλυνση καθυστέρησε τη σεξουαλική ωρίμανση των αρσενικών τόσο σε εκείνα που τράφηκαν με υδρολυμένη μαγιά και ζάχαρη όσο και εκείνων που τράφηκαν μόνο με ζάχαρη, γ) μείωσε δραστικά την ανταγωνιστικότητα σύζευξης των αρσενικών όταν μελετήθηκε σε μικρά ατομικά κλουβιά (όγκου 400 cm3), και τέλος δ) δεν επηρέασε σημαντικά την αποθήκευση σπέρματος στις σπερματοθήκες των θηλυκών. Επίσης, στο πλαίσιο της πρώτης ενότητας πειραμάτων μελετήθηκε η επίδραση της μόλυνσης με Wolbachia των αρσενικών και των θηλυκών ατόμων της μύγας της Μεσογείου στη δεκτικότητα σύζευξης και επανασύζευξης, καθώς και η επίδραση του ιστορικού των συζεύξεων στα δημογραφικά χαρακτηριστικά (ωοπαραγωγή, εκκόλαψη των αυγών, διάρκεια ζωής) μολυσμένων και μη-μολυσμένων με Wolbachia θηλυκών της μύγας της Μεσογείου. Εν συντομία, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι: α) η μόλυνση είτε των θηλυκών είτε των αρσενικών τροποποίησε τα ποσοστά σύζευξης και επανασύζευξης, β) τα μολυσμένα με Wolbachia θηλυκά απόθεσαν περισσότερα αυγά σε σύγκριση με τα μη-μολυσμένα θηλυκά. Η μολυσματική κατάσταση των αρσενικών δεν επηρέασε την ωοπαραγωγή. Ο αριθμός των συζεύξεων (μία ή δύο) των θηλυκών δεν επηρέασε την ωοπαραγωγή τους, γ) η μόλυνση των θηλυκών με Wolbachia μείωσε δραματικά τα ποσοστά εκκόλαψης των προνυμφών. Επιπλέον, το σπέρμα των μολυσμένων αρσενικών έδειξε πως ανταγωνίζεται επιτυχώς το σπέρμα των μη-μολυσμένων αρσενικών για τη γονιμοποίηση των αυγών των μη-μολυσμένων θηλυκών, δ) τα μολυσμένα με Wolbachia επανασυζευγμένα θηλυκά έζησαν περισσότερο από τα μη-μολυσμένα επανασυζευγμένα θηλυκά, παρότι η διάρκεια ζωής δεν διέφερε μεταξύ των μολυσμένων και μη-μολυσμένων θηλυκών που συζεύχθηκαν μόνο μία φορά. Επιπλέον, η επανασύζευξη των θηλυκών επέφερε κόστος στη διάρκεια ζωής μόνο των μη-μολυσμένων θηλυκών. Αντίθετα, η επανασύζευξη των μολυσμένων θηλυκών αύξησε τη διάρκεια ζωής τους σε σύγκριση με τα μολυσμένα θηλυκά που συζεύχθηκαν μόνο μία φορά. Η μολυσματική κατάσταση των αρσενικών δεν επηρέασε τη επιβίωση των θηλυκών σεξουαλικών συντρόφων τους. Η δεύτερη πειραματική ενότητα επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση της προοπτικής συνεισφοράς των συμβιωτικών οργανισμών (Wolbachia, βακτήρια του πεπτικού συστήματος) στη μαζική παραγωγή εντόμων υψηλής βιολογικής ποιότητας για εφαρμογή σε προγράμματα καταπολέμησης εντόμων. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους χώρους του εργαστηρίου FAO/IAEA Insect Pest Control Laboratory (IPCL), στο Seibersdorf της Αυστρίας. Χρησιμοποιήθηκαν έντομα αποικιών της μύγας της Μεσογείου που εκτρέφονταν σε συνθήκες μαζικής εκτροφής μικρής κλίμακας και εξετάσθηκε η επίδραση του Wolbachia σε βασικές βιολογικές παραμέτρους της αρμοστικότητας των εντόμων καθώς και η προβιοτική δράση του Enterobacter sp.. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το βακτήριο Wolbachia επηρέασε σημαντικά αρκετές παραμέτρους της αρμοστικότητας (fitness) της μύγας της Μεσογείου σε συνθήκες μαζικής εκτροφής μικρής κλίμακας. Η μείωση των ποσοστών εκκόλαψης των προνυμφών και συνεπώς ο μειωμένος αριθμός ανακτηθέντων ενηλίκων, αποτέλεσε το πιο αξιοσημείωτο των ευρημάτων. Επιπλέον, διαπιστώθηκε μείωση στη διάρκειας ανάπτυξης των ανηλίκων σταδίων του πληθυσμού Vienna 8 GSS ως συνέπεια της μόλυνσης. Η φυλή wCer2 του βακτηρίου δεν επηρέασε ούτε τη διάρκεια ζωής ούτε την ωοπαραγωγή των θηλυκών της μύγας της Μεσογείου, παρότι η φυλή wCer4 φαίνεται να επάγει μείωση τόσο της διάρκειας ζωής όσο και της ωοπαραγωγής των μολυσμένων θηλυκών. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν επίσης, ότι η ανταγωνιστικότητα σύζευξης των αρσενικών σε κλωβούς υπαίθρου, η ικανότητα πτήσης των ενηλίκων και η ικανότητα επιβίωσης υπό συνθήκες έλλειψης νερού και τροφής επηρεάζονται σημαντικά από τη φυλή του εντόμου καθώς και από τη φυλή του βακτηρίου (αλληλεπίδραση των δύο γενοτύπων). Τα αποτελέσματα της μελέτης των βακτηρίων του πεπτικού συστήματος συνοψίζονται ως εξής: α) από το πεπτικό σύστημα προνυμφών και ενηλίκων εντόμων (αρσενικών και θηλυκών) απομονώθηκαν τα γένη των βακτηρίων Providencia, Enterobacter, και Acinetobacter, β) η προσθήκη Enterobacter sp., ιδιαίτερα με τη μορφή ζωντανών βακτηρίων στην τροφή των προνυμφών, οδήγησε σε αυξημένο αριθμό νυμφών και ενηλίκων καθώς και σε ταχύτερη ανήλικη ανάπτυξη, κυρίως των αρσενικών, γ) η προσθήκη βακτηρίων στην προνυμφική τροφή δεν επηρέασε το βάρος των νυμφών, την αναλογία φύλου, την ανταγωνιστικότητα σύζευξης των αρσενικών, την ικανότητα πτήσης των ενηλίκων και την ικανότητα επιβίωσης υπό συνθήκες έλλειψης νερού και τροφής. Τα δεδομένα των παραπάνω πειραμάτων συμβάλλουν στην πληρέστερη κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών δράσης του συμβιωτικού βακτηρίου Wolbachia και των αλλαγών που επιφέρει η μόλυνση σε βασικές παραμέτρους της βιολογίας και συμπεριφοράς της μύγας της Μεσογείου. Επιπλέον, υπό το πρίσμα των ιδιαίτερων συνθηκών που συνεπάγεται η μαζική εκτροφή των εντόμων, αξιολογήθηκε η επίδραση της βακτηριακής μόλυνσης με Wolbachia και της χορήγησης Enterobacter sp. μέσω της τροφής των προνυμφών σε βασικές βιολογικές παραμέτρους, οι οποίες είναι ενδεικτικές της «ποιότητας» των παραγόμενων εντόμων. Συζητείται η προοπτική συνεισφοράς των συμβιωτικών οργανισμών (Wolbachia, βακτήρια του πεπτικού συστήματος) στην καταπολέμηση της μύγας της Μεσογείου μέσω των προγραμμάτων εξαπόλυσης στειρωμένων εντόμων (Sterile Insect Technique, Incompatible Insect Technique) και προτείνονται δυνατότητες περαιτέρω έρευνας.