Διαταραχές της προσαρμοστικής ανοσίας σε ασθενείς με νόσο Gaucher τύπου 1

Abstract

Gaucher’s disease is a systemic metabolic disorder, with clear clinical and laboratory evidence of chronic stimulation of the immune system, especially of the acquired immunity arm. The goal of the present dissertation was to investigate the status of the Th1/Th2 balance.Totally twenty-two patients with Gaucher’s disease type 1 were studied (range 16-67 years). They were divided into 4 groups, one as a whole patient population and the others, based on the presence/absence of bone complications or/and splenectomy. A group of 19 healthy individuals (range 26-70 years) was also included in the study and served as controls.Specific T-lymphocyte subpopulations of the peripheral blood were measured (in absolute numbers and percentages) by using whole blood flow cytometry. The concentrations of Th1- and Th2-direction cytokines in the supernatant of simple liquid T-lymphocyte cultures were determined with ELISA.All patients with Gaucher’s disease type 1, as well as the group without complications and that with bone complications were found to have statistically significant decrease of the absolute helper/inducer CD4+ T-lymphocyte counts, compared to the control group (774 ± 326 versus 1036 ± 278/μl, p= 0.011, 674 ± 211 versus 1036 ± 278/μl, p<0.001 and 718 ± 336 versus 1036 ± 278/μl, p= 0.022, respectively). As for the suppressor/cytotoxic CD8+ T-lymphocytes, patients as a whole group, and those with bone complications had significantly higher counts, compared to the normal control group (23.8 ± 7.9%, p = 0.010 and 24.8 ± 6.2%, p = 0.018, respectively, versus 18.2 ± 3.8% of the controls). Splenectomised patients had significantly higher percentage and absolute number of peripheral blood CD8+ T-lymphocytes (27.6 ± 7.8% versus 18.2 ± 3.8%, p = 0.001 και 849 ±397/μl versus 378 ± 109/μl, p< 0.001, respectively). Additionally, in all 4 patient groups, a significant decrease of CD4/CD8 ratio was found, compared to the control group (1.9 ± 0.8, p< 0.001, 2.2 ± 0.8, p = 0.018, 1.9 ± 0.5, p = 0.006, and 1.5 ±0.5 versus 2.9 ± 0.8 of the control, p< 0.001 respectively).The study of the NK cells revealed that patients as a whole group and those without serious disease-related complications had mean absolute NK-non T-lymphocytes counts approximately two times lower than those of the control group. Patients with bone complications had the CD3-CD56+, CD3-CD56dim and CD3-CD56dim+CD16+ subpopulations of the ΝΚ cells, approximately 3 times lower. However, in all the above cases, the aforementioned differences were not statistically significant.The populations of stimulated CD4+ and CD8+ helper/inducer T-lymphocytes, based on the expression of the HLA-DR antigen, were found significantly higher among the splectomized patients, compared to the control group (103 ± 56/μl versus 48 ± 15/μl, p = 0.003 and 201 ± 155 versus 41 ± 17/μl, p< 0.001, respectively). Additionally, based on the weak expression of the CD25 antigen, patients as a whole group and those, who were free of complications had significantly decreased absolute number of activated helper CD4+ T-lymphocytes (CD4+CD25dim), compared to healthy controls (7.7 ± 6.3/μl versus 17.1 ± 7.7/μl, p = 0.007 and 8.7 ± 6.8/μl versus 17.1 ± 7.7/μl, p = 0.033 respectively).Concerning the absolute number of regulatory T-lymphocytes (CD4+CD25highFoxp3+), it was found significantly lower in the combined patient’s group and in the group that was free of complications, as well as in the group exhibiting bone complications, compared to the group of healthy individuals (1.6 ± 1.1/μl, p = 0.019, 1.7 ± 1.3/μl, p = 0.028, and 1.1 ± 0.3/μl, p = 0.031 respectively, versus 2.9 ± 1.3/μl of the healthy control group).Study of the intracellular expression of cytokines revealed that all patient groups had significantly higher percentage of IFN-γ producing CD4+ Τ-lymphocytes, in comparison to the control group (39.3 ± 12.0% versus 22.2 ± 7.0%, p< 0.001 in the combined patients group, 34.4 ± 11.4% versus 22.2 ± 7.0% in patients without complications, p = 0.016, and 46.8 ± 8.4% versus 22.2 ± 7.0%, p < 0.001 in patients with bone complications or/and splenectomy). The same finding was observed concerning the CD8+ cytotoxic/suppressor T-lymphocytes that produced IFN-γ in the whole patient group and in that with bone complications or/and splenectomy (65.3 ± 22.8%, p = 0.023 and 83.2 ± 8.9%, p< 0.001, respectively, compared to 46.0 ± 14.2%, of the control group).In addition, in the group of patients with bone complications or/and splenectomy, a significant increase in the levels of Th1 cytokines IFN-γ and IL-2 was observed (1845 ± 1563 pg/ml versus 516 ± 572 pg/ml, p = 0.034 and 700 ±605pg/ml versus 318 ± 316 pg/ml, p=0.041 respectively). The same conclusion was observed concerning the regulatory cytokine IL-10, in comparison to the control group (189 ± 112 pg/ml versus 55 ± 78 pg/ml, p= 0.026). All the above were measured in the supernatant of liquid, mitogen-stimulated T-lymphocyte cultures.In conclusion, our study showed that patients with Gaucher’s disease of type 1 exhibit distinct deregulation of the acquired immune system, in the form of a non-controlled immune response profile (inversion of CD4/CD8 ratio, low number of T-regulatory cells, increased percentage of cells that produce IFN-γ and elevated levels of Th1 cytokines), the intensity of which is related with the severity of the clinical disease. Thus, this profile, potentially attributes to the establishment of the low grade chronic inflammatory status, which has been observed in this particular group of patients.

Η νόσος Gaucher είναι ένα συστηματικό νόσημα με σαφείς ενδείξεις χρόνιας διέγερσης του ανοσοποιητικού συστήματος, και δη του σκέλους της επίκτητης ανοσίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν κυρίως να διερευνήσει τη κατάσταση στην οποία βρίσκεται η Th1/Th2 ισορροπία. Μελετήθηκαν 22 ασθενείς με νόσο Gaucher τύπου 1 (εύρος ηλικίας 16-67 έτη), οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε 4 ομάδες, μία ως σύνολο και οι υπόλοιπες με βάση τη παρουσία ή την απουσία οστικών επιπλοκών ή/και σπληνεκτομής. Για τη σύγκριση χρησιμοποιήθηκε ομάδα (control group) με 19 φυσιολογικούς μάρτυρες (εύρος ηλικίας 26-70).Προσδιορίστηκαν ποσοτικά (απόλυτοι αριθμοί και ποσοστά) συγκεκριμένοι Τ-λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί του περιφερικού αίματος με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής, καθώς και οι συγκεντρώσεις Th1 & Th2 κυτταροκινών στο υπερκείμενο απλών Τ-λεμφοκυτταρικών υγρών καλλιεργειών με τη μέθοδο ELISA.Όλοι οι ασθενείς με νόσο Gaucher τύπου 1, καθώς και οι ομάδες εκείνων ελεύθερων επιπλοκών και αυτών με οστικές διαταραχές παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικά ελαττωμένο τον απόλυτο αριθμό των βοηθητικών/επαγωγικών CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων, συγκριτικά με τους μάρτυρες ( 774 ± 326/μl έναντι 1036 ± 278/μl, p = 0.011, 674 ± 211/μl έναντι 1036 ± 278/μl, p<0.001 και 718 ± 336/μl έναντι 1036 ± 278/μl, p = 0.022, αντίστοιχα). Όσον αφορά τα κατασταλτικά/κυτταροτοξικά CD8+ Τ-λεμφοκύτταρα, οι ασθενείς στο σύνολό τους καθώς και εκείνοι με οστικές επιπλοκές εμφάνισαν στατιστικώς σημαντικά αυξημένο το ποσοστό τους, συγκριτικά με τους φυσιολογικούς μάρτυρες (23.8 ± 7.9%, p = 0.010 και 24.8 ± 6.2%, p = 0.018, αντίστοιχα, έναντι 18.2 ± 3.8% των μαρτύρων), ενώ οι σπληνεκτομηθέντες ασθενείς είχαν στατιστικώς σημαντικά αυξημένο, τόσο το ποσοστό, όσο και τον απόλυτο αριθμό των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων (27.6 ± 7.8% έναντι 18.2 ± 3.8%, p = 0.001 και 849 ± 397/μl έναντι 378 ± 109/μl, p < 0.001, αντίστοιχα). Επιπρόσθετα, και στις 4 ομάδες των ασθενών διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική ελάττωση του λόγου CD4/CD8, σε σχέση με την ομάδα των μαρτύρων (1.9 ± 0.8, p < 0.001, 2.2 ± 0.8, p = 0.018, 1.9 ± 0.5, p = 0.006, και 1.5 ± 0.5 έναντι 2.9 ± 0.8 των μαρτύρων, p < 0.001 αντίστοιχα).Η μελέτη των ΝΚ κυττάρων έδειξε ότι οι ασθενείς στο σύνολό τους, καθώς και εκείνοι χωρίς σοβαρές επιπλοκές εκ της νόσου, διαπιστώθηκε να έχουν μέσους απόλυτους αριθμούς των NK μή T- λεμφοκυττάρων περίπου 2 φορές χαμηλότερους, συγκριτικά με τους μάρτυρες, ενώ οι ασθενείς με οστικές επιπλοκές είχαν τους υποπληθυσμούς CD3-CD56+, CD3-CD56dim και CD3-CD56dim+ CD16+ των ΝΚ κυττάρων τους, περίπου 3 φορές χαμηλότερους. Όμως, σε όλες τις ανωτέρω περιπτώσεις αυτές οι διαπιστωθείσες διαφορές δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές. Οι πληθυσμoί των διεγερμένων CD4+ και CD8+ βοηθητικών/επαγωγικών Τ-λεμφοκυττάρων, με βάση την έκφραση του αντιγόνου HLA-DR, βρέθηκε να είναι στατιστικώς σημαντικά αυξημένος στους σπληνεκτομηθέντες ασθενείς, συγκριτικά με τους μάρτυρες (103 ± 56/μl έναντι 48 ± 15/μl, p = 0.003 και 201 ± 155/μl έναντι 41 ± 17/μl, p < 0.001, αντίστοιχα). Ακόμη, και με βάση την ασθενή έκφραση του αντιγόνου CD25, παρατηρήθηκε ότι οι ασθενείς στο σύνολό τους καθώς και εκείνοι χωρίς επιπλοκές είχαν στατιστικώς σημαντικά μειωμένο τον απόλυτο αριθμό των ενεργοποιημένων βοηθητικών CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων (CD4+CD25dim ) , συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες (7.7 ± 6.3/μl έναντι 17.1 ± 7.7/μl, p = 0.007 και 8.7 ± 6.8/μl έναντι 17.1 ± 7.7/μl, p = 0.033 αντίστοιχα).Όσον αφορά τα ρυθμιστικά Τ λεμφοκύτταρα (CD4+CD25high Foxp3+ ), βρέθηκε ότι ο απόλυτος αριθμός τους ήταν στατιστικώς σημαντικά ελαττωμένος στο σύνολο των ασθενών, καθώς και στις υποομάδες των ασθενών χωρίς επιπλοκές και εκείνων με οστικές αλλοιώσεις, συγκριτικά με τους υγιείς μάρτυρες (1.6 ± 1.1/μl, p = 0.019, 1.7 ± 1.3/μl, p = 0.028, και 1.1 ± 0.3/μl, p = 0.031 αντίστοιχα, έναντι 2.9 ± 1.3/μl των υγιών μαρτύρων).Η μελέτη της ενδοκυττάριας έκφρασης κυτταροκινών ανέδειξε ότι όλες οι ομάδες των ασθενών είχαν στατιστικώς σημαντικά αυξημένο το ποσοστό των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων, που παρήγαγαν IFN-γ, συγκριτικά με τους μάρτυρες (39.3 ± 12.0% έναντι 22.2 ± 7.0%, p < 0.001 στο σύνολο των ασθενών, 34.4 ± 11.4% έναντι 22.2 ± 7.0% στους ασθενείς χωρίς επιπλοκές, p = 0.016, και 46.8 ± 8.4% έναντι 22.2 ± 7.0%, p < 0.001 στους ασθενείς με οστικές επιπλοκές ή/και σπληνεκτομή). Το ίδιο παρατηρήθηκε και για τα CD8+ διεγερμένα κυτταροτοξικά/κατασταλτικά Τ-λεμφοκύτταρα, που παρήγαγαν IFN-γ, στο σύνολο των ασθενών και σε εκείνους με οστικές επιπλκοές ή/και σπληνεκτομή (65.3 ± 22.8%, p = 0.023 και 83.2 ± 8.9%, p < 0.001, αντίστοιχα, έναντι 46.0 ± 14.2%, των μαρτύρων).Επιπρόσθετα, στην ομάδα των ασθενών με οστικές αλλοιώσεις ή/και σπληνεκτομή παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντική αύξηση των επιπέδων των Th1 κυτταροκινών IFN-γ και IL-2 (1845 ± 1563 pg/ml έναντι 516 ± 572 pg/ml, p = 0.034 και 700 ± 605 pg/ml έναντι 318 ± 316 pg/ml, p = 0.041 αντίστοιχα), καθώς και της ρυθμιστικής κυτταροκίνης IL-10, συγκριτικά με τους μάρτυρες (189 ± 112 pg/ml έναντι 55 ± 78 pg/ml, p = 0.026), όπως αυτές προσδιορίστηκαν στο υπερκείμενο απλών Τ λεμφοκυτταρικών καλλιεργειών.Συμπερασματικά, η μελέτη μας έδειξε ότι οι ασθενείς με νόσο Gaucher τύπου 1 παρουσιάζουν σημαντική απορρύθμιση του συστήματος της προσαρμοστικής ανοσίας, με τη μορφή ενός προφίλ μη ελεγχόμενης ανοσοαπόκρισης (αναστροφή του λόγου CD4/CD8, χαμηλό αριθμό Τ ρυθμιστικών κυττάρων, αυξημένο ποσοστό κυττάρων που παράγουν IFN-γ και αυξημένη συγκέντρωση Th1 κυτταροκινών), η βαρύτητα του οποίου σχετίζεται με τη σοβαρότητα του κλινικού φαινότυπου της νόσου. Έτσι λοιπόν, το προφίλ αυτό πιθανώς να συμβάλει στην εγκαθίδρυση της χαμηλού βαθμού χρόνιας φλεγμονής που έχει παρατηρηθεί στους συγκεκριμένους ασθενείς.