Διερεύνηση της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης του c-myc mRNA από πρωτεΐνες πρόσδεσης RNA

Abstract

Aberrant expression of c-MYC is involved in many stages of carcinogenesis. Thus, its expression requires tight control on many levels including post transcriptional regulation. c-myc mRNA carries within the coding region a 249 nucleotide sequence (Coding Region instability Determinant -CRD) that confers instability and suppresses translation. This sequence is recognized by the mRNA binding protein IMP1, which stabilizes c-myc mRNA, protecting it from endonucleases. IMP1 is expressed in fetal tissues and de novo in malignancies. It is phosphorylated at Tyr 396 by Src kinase and at Ser 181 by mTORC2, respectively. In this study, the possible effect of these modifications upon the expression of c-MYC was investigated. The translatability of the chimaeric transcripts carrying the CRD c-myc sequence, in frame, was reduced by 35% in the presence of the Src kinase inhibitor (SrcI1) although the corresponding levels of mRNA were increased. Chimaeric luciferase plasmids carrying the CRD c-myc sequence, were co-transfected with plasmids expressing the wild-type IMP1 protein (IMP1wt) or its mutant counterpart (IMP1Y396F). IMP1wt reduced translatability by 20% while over-expression of the mutant protein by 35%. Inhibition of Src activity in the presence of IMP1wt further reduced the translatability of the chimaeric transcripts. IMP1Y396F or IMP1wt in the presence of the Src inhibitor, were detected in cytoplasmic granules. Under these conditions, the endogenous c-myc mRNA was stabilized, although it was not translated indicating that in the absence of Src signaling IMP1 stored reversibly c-myc mRNA in cytoplasmic granules.Inhibition of mTORC2 signaling resulted in the destabilization of chimaeric transcripts as well as of the endogenous c-myc mRNA, 20% and 32%, respectively. However, an increase of 80% in c-ΜΥC protein levels was observed in the presence of the Torin1 inhibitor, while the presence of the IMP1S181A protein doubled c-ΜΥC levels and caused apoptosis in 23% of the cells.In order to augment c-ΜΥC expression and enhance apoptosis, sequential inhibition of IMP1 phosphorylation by the two pathways was applied. The accumulated ''stored'' c-myc mRNA, due to the presence of SrcI1 for 48 hours, after the subsequent exposure of the cells to the inhibitor Torin1 yielded increased protein levels of both the chimaeric transcripts carrying the CRD sequence and the endogenous c-ΜΥC, 2.5 and 3 fold, respectively. Such an increase in c- MYC levels caused apoptosis in 44% of the cell population.Finally, the effect of the sequential action of the Src kinase inhibitor AZD0530 and Torin1, upon HeLa cell xenografts was evaluated. Administration of the AZD0530 inhibitor did not cause any change in tumor growth rate. However, the prior exposure of tumor cells to AZD0530 enhanced the effect of Torin1. The sequential use of the two substances resulted in statistically significant inhibition of the xenograft growth compared to those exposed to Torin1 alone.

Η έκτοπη έκφραση της πρωτεΐνης c-ΜΥC εμπλέκεται σε πολλά στάδια καρκινογένεσης. Ως εκ τούτου, η έκφρασή της απαιτεί αυστηρό έλεγχο σε πολλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένης της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης. Το c-myc mRNA φέρει εντός της κωδικής περιοχής μία αλληλουχία 249 νουκλεοτιδίων (Coding Region instability Determinant- CRD) που προσδίδει αστάθεια και καταστέλλει τη μετάφραση. Αυτή η αλληλουχία αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη πρόσδεσης mRNA ΙΜΡ1, η οποία σταθεροποιεί το c-myc mRNA, προστατεύοντάς το από ενδονουκλεάσες. Η ΙΜΡ1 εκφράζεται σε εμβρυϊκούς ιστούς και de novo σε κακοήθειες. Φωσφορυλιώνεται στο κατάλοιπο Tyr 396 από την κινάση Src και στο κατάλοιπο Ser181 από την κινάση mTORC2, αντίστοιχα.Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η πιθανή επίδραση αυτών των τροποποιήσεων στην έκφραση της c-ΜΥC. Η μεταφρασιμότητα των χιμαιρικών μετάγραφων που φέρουν την αλληλουχία CRD του c-myc mRNA, εντός πλαισίου ανάγνωσης, μειώθηκε κατά 35% παρουσία του αναστολέα της κινάσης Src (SrcI1) αν και τα αντίστοιχα επίπεδα του mRNA αυξήθηκαν. Τα χιμαιρικά πλασμίδια λουσιφεράσης που φέρουν την αλληλουχία CRD, συνδιαμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν την πρωτεΐνη IMP1 αγρίου τύπου (IMP1wt) ή το μεταλλαγμένο ομόλογό της (ΙΜΡ1Υ396F). Η IMP1wt μείωσε την μεταφρασιμότητα κατά 20% ενώ η υπερεκφράση της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης κατά 35%. Η αναστολή της δράσης της Src παρουσία IMP1wt μείωσε περαιτέρω την μεταφρασιμότητα των χιμαιρικών μεταγραφών. Οι ΙΜΡ1Υ396F ή IMP1wt παρουσία του αναστολέα, εντοπίστηκαν σε κυτταροπλασματικά κοκκία. Υπό αυτές τις συνθήκες, το ενδογενές c-myc mRNA σταθεροποιήθηκε, αν και δεν μεταφράστηκε υποδεικνύοντας ότι απουσία σηματοδότησης Src, η ΙΜΡ1 αποθηκεύει αντιστρεπτά το c-myc mRNA σε κυτταροπλασματικές δομές. Η αναστολή της mTORC2 σηματοδότησης είχε ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση των χιμαιρικών μετάγραφων καθώς και του ενδογενούς c-myc mRNA, 20% και 32% αντίστοιχα. Εντούτοις, παρατηρήθηκε αύξηση κατά 80% στα επίπεδα της πρωτεΐνης c-ΜΥC παρουσία του αναστολέα Torin1, ενώ η παρουσία της πρωτεΐνης IMP1S181A διπλασίασε τα επίπεδα της πρωτεΐνης c-ΜΥC και προκάλεσε απόπτωση στο 23% των κυττάρων.Για να επιτευχτεί περαιτέρω αύξηση της έκφρασης της c-ΜΥC και ενίσχυση της απόπτωσης εφαρμόστηκε διαδοχική αναστολή της φωσφορυλίωσης της ΙΜΡ1 μέσω των δύο οδών. Το συσσωρευμένο c-myc mRNA, λόγω της παρουσίας SrcI1 για 48 ώρες, κατόπιν της επακόλουθης έκθεσης των κυττάρων στον αναστολέα Torin1 απέδωσε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης τόσο των χιμαιρικών μετάγραφων που φέρουν την αλληλουχία CRD όσο και της ενδογενούς c-ΜΥC, 2,5 και 3 φορές, αντίστοιχα. Η αύξηση αυτή των επιπέδων της c-ΜΥC προκάλεσε απόπτωση στο 44% του κυτταρικού πληθυσμού.Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της διαδοχικής δράσης του αναστολέα κινάσης Src AZD0530 και Torin1, σε ξενομοσχεύματα HeLa κυττάρων. Η χορήγηση του αναστολέα AZD0530 δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στον ρυθμό ανάπτυξης των όγκων. Προηγηθείσα όμως έκθεση των καρκινικών κυττάρων στον AZD0530 ενίσχυσε τη δράση του Torin1. Η διαδοχική χρήση των δύο ουσιών οδήγησε σε στατιστικά σημαντική αναστολή της αύξησης του μεγέθους των ξενομοσχευμάτων σε σύγκριση με εκείνους που εκτέθηκαν μόνο στον Torin1.