Λειτουργικοί λιποσωμιακοί και δενδριτικοί φορείς βιοφαρμακευτικών ουσιών

Abstract

The purpose of this thesis is the development of novel functional liposomal and dendritic drugdelivery systems for efficient insulin encapsulation and their study as potential oral insulindelivery systems.In the first part of this study, unilamellar PEGylated liposomes were prepared which canencapsulate up to 4 mg/mL of insulin. For these systems it is possible to control insulin’srelease rate, at pH 7.4, by varying the number of liposomal surface grafted PEG chains.Moreover, it was shown that degradation of liposomal insulin by proteolytic enzymes issignificantly reduced compared to free insulin.In the second part, the complexation of insulin with a poly(L-lysine) dendrigraft (DL) and aseries of arginine end-functionalized DL or with PEGylated oligolysine and oligoargininehomopeptides at physiological pH was investigated. These positively charged polymersinteract spontaneously with insulin, affording stable ionic complexes, with insulincomplexation efficiencies exceeding 99%. The interaction was studied by dynamic lightscattering, ζ-potential, circular dichroism (CD), and isothermal titration calorimetry. Bindingoccurs in two steps: at low polymer/insulin molar ratios (< 0.1) interaction is accompaniedwith the endothermic dissociation of insulin dimers, while at higher molar ratios complexationof insulin monomers with the polymeric derivatives occurs exothermically. Stabilization ofcomplexed insulin against enzymatic degradation is observed, especially for the highly endfunctionalized arginine dendrigrafts and for the higher molecular weight PEGylatedoligoarginine derivative. Insulin release rates in simulated intestinal fluid can be controlled bythe number of arginine end-groups and by the length of PEG chains. More importantly,released insulin retains its secondary structure as established by CD.In conclusion, complexes of arginine-based peptides with insulin have significant potential as novel insulin delivery systems, given their biodegradable character, the presence of arginineend-groups that are known to enhance insulin intestinal absorption, the ability to controlinsulin release rate and the improved protection of insulin against enzymatic degradation.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων λειτουργικών λιποσωμάτων και δενδριτικών πολυμερών για να χρησιμοποιηθούν ως φορείς βιοφαρμακευτικών ουσιών. Μελετήθηκαν νέοι λιποσωμιακοί και δενδριτικοί φορείς κατάλληλοι για τον εγκλεισμό της ινσουλίνης και μελετήθηκαν ως δυνητικοί φορείς δια την από του στόματος χορήγηση της. Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρασκευάσθηκαν μονοστοιβαδικά λιποσώματα, μελετήθηκε ο εγκλεισμός της ινσουλίνης σε αυτά, με μέγιστη τιμή 4 mg/mL, και μετρήθηκε ο ρυθμός αποδέσμευσης της ινσουλίνης σε pH 7.4. Βρέθηκε ότι είναι δυνατή η ρύθμιση της αποδέσμευσης της ινσουλίνης μεταβάλλοντας το ποσοστό επικάλυψης των λιποσωμάτων με PEG. Σημαντικά βελτιωμένη είναι η αποικοδόμηση της εγκλεισμένης σε λιποσώματα ινσουλίνης υπό την επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων. Στο δεύτερο μέρος παρασκευάστηκαν παράγωγα του εμβολιασμένου δενδριτικού πολυμερούς της πολυ(L-λυσίνης) δεύτερης γενιάς με 12-48 ομάδες γουανιδίνης στην εξωτερική επιφάνειά της καθώς και παράγωγα ολιγο(L-λυσίνης) και ολιγο(αργινίνης) που φέρουν αλυσίδες PEG (Μw = 750 ή 2000 Da), που είναι ικανά να συμπλέξουν την ινσουλίνη σε ποσοστό > 99%. Η αλληλεπίδραση της ινσουλίνης με τα παραπάνω παράγωγα μελετήθηκε με μικροθερμιδομετρία ισόθερμης τιτλοδότησης (ITC), δυναμική σκέδαση φωτός και μετρήσεις ζ-δυναμικού. Μελέτες αποδέσμευσης της ινσουλίνης σε προσομοιωμένο εντερικό υγρό έδειξαν ότι η αποδέσμευση εξαρτάται από τον αριθμό των τελικών αργινινικών ομάδων στην περίπτωση των πολυμερικών παραγώγων, ενώ στα ολιγοπεπτιδικά παράγωγα εξαρτάται τόσο από το μοριακό βάρος του PEG όσο καιαπό τον αριθμό των γουανιδινικών ομάδων. Με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού(CD) επιβεβαιώνεται ότι η ινσουλίνη διατηρεί την δευτεροταγή της δομή μετά από την αποδέσμευσή της. Τέλος σε όλες τις περιπτώσεις η δεσμευμένη ινσουλίνη προστατεύεται έναντι των ενζύμων θρυψίνη και α-χυμοθρυψίνη και ο βαθμός προστασίας εξαρτάται είτε από μοριακό βάρος του PEG ή από τον αριθμό των γουανιδινικών ομάδων.