Μικρο-ρευστονικές διατάξεις για χρωματογραφία και βιοεφαρμογές σε μικροεργαστήριο ψηφίδας

Abstract

The aims of this PhD dissertation are the design, fabrication, characterization and theoretical analysis of microfluidic devices for chromatographic separations. The largest part of this dissertation concerns mainly two devices for purification of bacterial (and secondarily human genomic) DNA with solid phase extraction. More specifically, the main contributions of this thesis are summarized below:A) A DNA purification microfluidic device was developed on poly(methyl methacrylate) (PMMA) plates. The device presents a high surface area and high density of carboxyl groups, due to the direct oxygen plasma etching and simultaneous micro-nanotexturing of the microchannel walls. Using solid phase extraction on chip the device is capable of purifying Salmonella bacterial DNA and a large dynamic range from 5 to 1.9x10^8 cells (corresponding to 26.3 fg – 2 x 500 ng) and a high efficiency of DNA purification was demonstrated. The bacterial DNA purification device was incorporated in an integrated Lab-on-a-chip platform, and was used successfully for Salmonella cell lysates and Salmonella spiked milk applications. A similar protocol and micro-nanotextured device was also preliminary and successfully evaluated for human genomic DNA purification targeting forensic applications.B) Furthermore, a second microfluidic device was developed, the plasma micro-nanotextured surface of which was chemically modified with polyamines. A pH-dependent protocol of Salmonella DNA binding/elution was optimized inside this device with high efficiency. This new advantageous microfluidic device and protocol does not require ethanol or chaotropic solutions, which are known inhibitors of downstream processes, such as DNA amplification or DNA detection. C) An analytical model with a simplified equation was developed for the binding kinetics of cells (such as bacteria) passing through a microchannel with simultaneous association on the microchannel walls bearing immobilized antibodies. This theoretical study is closely related to food safety issues and is a useful predictive tool for chip designs. D) Finally, a cyclo-olefin (COP) polymeric microcolumn comprising a highly dense array of micropillars was evaluated for reversed phase chromatography. Highly demanding fabrication was employed, using hot embossing with a Si master of a COP plate supporting a temperature gradient, followed by sealing via thermal bonding in a laminator. Preliminary separations of acetaminophen and propylparaben solutions are shown.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει τον σχεδιασμό, κατασκευή, χαρακτηρισμό και θεωρητική ανάλυση μικρο-ρευστονικών διατάξεων για χρωματογραφικούς διαχωρισμούς. Το μεγαλύτερο μέρος της διατριβής αφορά κυρίως δύο διατάξεις για καθαρισμό βακτηριακού (και δευτερευόντως ανθρώπινου γενωμικού) DNA με εκχύλιση στερεάς φάσης. Πιο συγκεκριμένα, τα επιτεύγματα της διατριβής συνοψίζονται παρακάτω:Α) Αναπτύχθηκε μια πολυμερική μικρο-ρευστονική διάταξη από πολύ(μεθακρυλικό μεθυλεστέρα) (PMMA) για καθαρισμό DNA. Η διάταξη έχει πολύ υψηλή ενεργή επιφάνεια και πυκνότητα καρβοξυλομάδων που οφείλονται στην απ’ ευθείας εγχάραξη με πλάσμα οξυγόνου και ταυτόχρονη μικρο-νανοΰφανση στο πολυμερικό της υπόστρωμα. Είναι ικανή να καθαρίσει με εκχύλιση στερεάς φάσης βακτηριακό DNA από Salmonella, και επέδειξε καθαρισμό DNA με μεγάλη δυναμική έκταση από 5 έως 1,9x10^8 κύτταρα (που αντιστοιχούν σε 26,3 fg – 2 x 500 ng) και υψηλή απόδοση. Η διάταξη καθαρισμού βακτηριακού DNA ενσωματώθηκε σε μια πλατφόρμα ολοκληρωμένου μικροεργαστηρίου σε ψηφίδα και χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία για εφαρμογή σε κυτταρολύματα από Salmonella και σε γάλα επιμολυσμένο με Salmonella. Ένα παρόμοιο πρωτόκολλο και μια διάταξη με το ίδιο μικρο-νανοϋφασμένο πολυμερικό υπόστρωμα χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς και για καθαρισμό ανθρώπινου γενωμικού DNA και αξιολογήθηκαν σε προκαταρκτικά πειράματα για εφαρμογές εγκληματολογικής έρευνας.Β) Επίσης, αναπτύχθηκε μια δεύτερη μικρο-ρευστονική διάταξη, της οποίας η μικρο-νανοϋφασμένη με πλάσμα επιφάνεια επικαλύφθηκε με πολυαμίνες. Σε αυτήν βελτιστοποιήθηκε ένα pH-εξαρτώμενο πρωτόκολλο πρόσδεσης/έκλουσης βακτηριακού DNA από Salmonella με υψηλή απόδοση. Το πλεονέκτημα αυτής της νέας διάταξης και πρωτοκόλλου που χρησιμοποιήθηκε, είναι ότι δεν απαιτεί χρήση αιθανόλης ή χαοτροπικού διαλύματος, που είναι γνωστοί παρεμποδιστές των κατάντη διεργασιών π.χ. της ενίσχυσης ή ανίχνευσης DNA. Γ) Αναπτύχθηκε ένα αναλυτικό μοντέλο με μια απλοποιημένη εξίσωση για την κινητική πρόσδεσης κυττάρων (όπως βακτήρια) που ρέουν μέσα από ένα μικροκανάλι και ταυτόχρονα δεσμεύονται πάνω στην επιφάνειά του εξαιτίας ακινητοποιημένων στην επιφάνεια αντισωμάτων. Η θεωρητική αυτή μελέτη συνδέεται με το θέμα της ασφάλειας τροφίμων και είναι ένα χρήσιμο εργαλείο πρόβλεψης για σχεδιασμό μικρο-ρευστονικών διατάξεων. Δ) Τέλος, αξιολογήθηκε μικροστήλη από πολυμερές κυκλο-ολεφίνης με πυκνή συστοιχία μικροκολόνων στο εσωτερικό της για χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Χρησιμοποιήθηκε μια πολύ απαιτητική κατασκευή με εν θερμώ αποτύπωση από σφραγίδα πυριτίου με βαθμίδα θερμοκρασίας και ακολούθησε στεγανοποίηση με θερμική συγκόλληση σε ελασματοποιητή. Η στήλη χρησιμοποιήθηκε για πρώτους διαχωρισμούς διαλυμάτων ακεταμινοφαίνης και προπυλοπαραβενίου.