Διευκρίνιση του ρόλου των ΗΙF στον μεταβολισμό λιπιδίων και στη φλεγμονή

Abstract

Hypoxia inducible factors (HIFs) mediate the survival of normal cells at low oxygen concentrations and cancer cells in the hypoxic tumor microenvironment. HIFs bind to the promoters of their target genes and regulate cellular functions, such as angiogenesis, erythropoiesis, proliferation and apoptosis. Particularly important is the role of HIF in the modification of carbohydrate metabolism by the activation of anaerobic glycolysis. Recent studies have shown that hypoxia and HIFs also affect lipid metabolism by inducing the expression of genes associated with increased storage, uptake and de novo fatty acid synthesis. Hypoxia and HIF appear to be involved in the development of hepatic disorders associated with the development of chronic inflammation, fibrosis and hepatocarcinoma, such as fatty liver disease, which is characterized by hepatic triglyceride accumulation. The purpose of this PhD thesis is the study of the effect of hypoxia and HIF-1α on the expression of target genes related to lipid synthesis, lipid storage and hepatocellular inflammation in cancer cell lines. Study of the effect of hypoxia and HIF-1α on the expression of genes involved in the triglyceride biosynthesis pathway has shown that 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase (AGPAT2) is induced under hypoxic conditions or in the presence of DMOG in Huh7 and HeLa cancer cell lines. Knock-down of HIF-1α using specific siRNA significantly inhibits induction of AGPAT2 expression under hypoxia. In addition, a sequence of the AGPAT2 gene promoter containing 6 possible HREs activates transcription of a reporter gene under hypoxic conditions or after overexpression of HIF-1α in normoxia. Silencing AGPAT2 with specific siRNA leads to reduced lipid droplet accumulation, reduced cell survival, and increased cell sensitivity to the etoposide chemotherapeutic drug under hypoxia. These findings indicate that AGPAT2 is a direct transcriptional target of HIF-1, suggesting that induction of lipid synthesis via HIF-1 contributes to the adaptation and survival of cancer cells under hypoxic conditions. The role of hypoxia and inflammation mediators (TNFα or LPS) in the development of EMT and fibrosis was investigated in Huh7 hepatoma cells. It was observed that hypoxia induces the expression of genes coding for mediators of fibrosis (TGF-β, PDGFC and PAI-1), EMT markers (E-cadherin, FSP-1) and fibrosis markers (LOX, P4HB and P4HA1), and that this induction is not significantly affected by the presence of TNFα or LPS. Silencing of HIF-1α reduces the hypoxic induction of PDGFC, E-cadherin, LOX and P4HA1 genes, indicating that these genes are potential HIF-1 targets. Finally, incubation of cells with SB431542, a specific inhibitor of the TGF-β ALK 5 receptor, reduces HIF-1α expression and affects the expression of TGF-β, LOX, P4HB, P4HA1 and E-cadherin genes in hypoxic conditions. In conclusion, hypoxia and HIF-1 mediating the induction of genes related to fibrosis and EMT are shown to be important regulators of the progression of hepatocyte inflammatory diseases.

Οι επαγόμενοι από την υποξία παράγοντες HIF μεσολαβούν την επιβίωση φυσιολογικών κυττάρων σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου και καρκινικών κυττάρων στο υποξικό μικροπεριβάλλον του όγκου. Οι HIF προσδένονται στους υποκινητές των γονιδίων στόχων τους και ρυθμίζουν κυτταρικές λειτουργίες, όπως η αγγειογένεση, η ερυθροποίηση, ο πολλαπλασιασμός και η απόπτωση. Ιδιαίτερα σημαντικός είναι ο ρόλος των HIF στην τροποποίηση του μεταβολισμού των υδατανθράκων, μέσω της ενεργοποίησης της αναερόβιας γλυκόλυσης. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η υποξία και οι HIFs επηρεάζουν και το μεταβολισμό των λιπιδίων μέσω της επαγωγής γονιδίων που σχετίζονται με αυξημένη αποθήκευση, πρόσληψη και de novo σύνθεση λιπαρών οξέων. H υποξία και οι HIF φαίνεται να εμπλέκονται στην εμφάνιση ηπατικών διαταραχών που συνδέονται με την ανάπτυξη χρόνιας φλεγμονής, ίνωσης και ηπατοκαρκινώματος, όπως η νόσος του λιπώδους ήπατος, που χαρακτηρίζεται από συσσώρευση τριγλυκεριδίων στα ηπατοκύτταρα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επίδρασης της υποξίας και του HIF-1α στην έκφραση γονιδίων στόχων που σχετίζονται με τη σύνθεση και αποθήκευση λιπιδίων και την ηπατοκυτταρική φλεγμονή σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Μελέτη της επίδρασης της υποξίας και του HIF-1α στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των τριγλυκεριδίων, υποδεικνύει ότι η ακυλομεταφοράση του φωσφατιδικού οξέος AGPAT2, επάγεται σε συνθήκες υποξίας ή παρουσία DMOG σε καρκινικές κυττταρικές σειρές Huh7 και HeLa. Η αποσιώπηση του HIF-1α με ειδικό siRNA αναστέλλει σε σημαντικό βαθμό την επαγωγή της έκφρασης της AGPAT2 στην υποξία. Επιπλέον, αλληλουχία του υποκινητή του γονιδίου της AGPAT2, που περιέχει 6 πιθανές θέσεις HREs ενεργοποιεί τη μεταγραφή ενός γονιδίου αναφοράς σε συνθήκες υποξίας ή κατόπιν υπερέκφρασης του HIF-1α σε νορμοξία. Η αποσιώπηση της AGPAT2 με ειδικό siRNA οδηγεί σε μειωμένη συσσώρευση λιποσταγονιδίων, μειωμένη κυτταρική επιβίωση και αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στο χημειοθεραπευτικό φάρμακο ετοποσίδιο, σε υποξία. Τα παραπάνω ευρήματα υποστηρίζουν ότι η AGPAT2 αποτελεί άμεσο μεταγραφικό στόχο του HIF-1, επιβεβαιώνοντας ότι η επαγωγή της σύνθεσης λιπιδίων μέσω του HIF-1 συνεισφέρει στην προσαρμογή και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων σε συνθήκες υποξίας. Ο ρόλος της υποξίας και των φλεγμονωδών παραγόντων (ΤΝΡα ή LPS) στην ανάπτυξη EMT και ίνωσης διερευνήθηκε σε κύτταρα ηπατοκαρκινώματος Huh7. Παρατηρήθηκε ότι η υποξία οδηγεί σε επαγωγή έκφρασης γονιδίων μεσολαβητών της ίνωσης (TGF-β, PDGFC και PAI-1), δεικτών ΕΜΤ (E-cadherin, FSP-1) και δεικτών ίνωσης (LOX, P4HB και P4HA1), η οποία δεν επηρεάζεται σημαντικά από φλεγμονώδεις παράγοντες. Αποσιώπηση του HIF-1α προκαλεί μείωση της επαγωγής των γονιδίων PDGFC, E-cadherin, LOX και P4HA1 από την υποξία, καθιστώντας αυτά τα γονίδια πιθανούς στόχους του HIF-1α. Τέλος, επώαση των κυττάρων με τον SB431542, ειδικό αναστολέα του υποδοχέα του TGF-β ALK 5, μειώνει την έκφραση του HIF-1α και επηρεάζει την έκφραση των γονιδίων TGF-β, LOX, P4HB, P4HA1 και E-cadherin σε συνθήκες υποξίας. Συμπερασματικά, η υποξία και ο HIF-1 μεσολαβώντας στην επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με την ίνωση και την EMT, αναδεικνύονται σημαντικοί ρυθμιστές της εξέλιξης φλεγμονωδών παθήσεων των ηπατοκυττάρων.