Μελέτη του ρόλου των συνδεκανών στην παθογένεια του ινοσαρκώματος και διερεύνηση της επίδρασης των αυξητικών παραγόντων

Abstract

The focus of the present PhD thesis was to further understand the underlyingmechanisms that are responsible for the progress of human adult fibrosarcoma. Withthe utilization of new, specialized techniques, which have resulted in newclassification systems it is defined as a rare tumor with poor prognosis. This softtissue sarcoma is derived from the malignant transformation of the fibroblasts, cellsknown to produce abundant extracellular matrix (ECM) which ultimately supportssurrounding tissues. Fibrosarcoma cells are morphologically characterized asspindle cells, with enhanced motility.It is well established that fibrosarcoma cells strongly modulate thesurrounding ECM. ECM is a complex extracellular network containingproteoglycans, fibrous proteins and hyaluronic acid, which supports and protectsthe cells within the tissues. Moreover, ECM is able to create and transfer multiplesignals to the cells, thus affecting their basic functions and behaviour. Indeed, ECMis a pool of growth factors, such as TGF (transforming growth factor), EGF(epidermal growth factor), FGF (fibroblast growth factor), VEGF (vascularendothelial growth factor), IGF-Ι (insulin-like growth factor), enzymes like theMMPs (matrix metalloproteinases), synthases, transferases, sulfases and a wholegroup of other interesting macromolecules which can affect cell behaviour.Proteoglycans are molecules composed of glycosaminoglycan chains (GAG),covalently attached to their protein core. They are classified according to their GAGchains into separate groups: KSPGs (keratan sulfate proteoglycans), HSPGs (heparansulfate proteoglycans), CSPGs (chondroitin sulfate proteoglycans) and DSPGs(dermatan sulfate proteoglycans). They possess the ability to affect cell functions andultimately the evolution of a tumour with various mechanisms. Τheir complexfunctionality comes not only from their basic morphology, but also from their finalstereotactic modification by specialized enzymes. These alterations can induceimportant changes like different localization, degradation and recycling, interplaywith other factors, let alone different signalling, both outwards and inwards of thecell. One of the unique proteoglycan characteristics is the direct contact with theECM and the consequent transport of environmental signals towards the inner partof the cells.Syndecan 2 (SDC2), a heparan sulfate proteoglycan, is known to be crucial forthe proliferation and migration of human fibrosarcoma cells (HT1080). SDC2 isrecognized to modify the actin cytoskeleton and consequently alter HT1080 cellmigration through the FAK/PI3K/Rac signalling pathway.One of the well-studied growth factors, proven to affect the progress offibrosarcoma, is TGFβ2. It has been reported that TGFβ2 can control the formation ofECM and subsequently, the invasiveness and migration of HT1080 cells.In this study, we show the ability of TGFβ2 to enhance the adhesion ofHT1080 cells towards fibronectin (FN) (p ≤ 0.01). Adhesion of cells to other cells aswell as the ECM is known to affect the invasive abilities of the cells. SDC2 seems tobe essential when it comes to TGFβ2-induced HT1080 cell adhesion, as this ability isremarkably down-regulated in SDC2-deficient cells (p ≤ 0.01).We also show that SDC2 is important for Smad2 activation, an indispensablemediator of TGFβ signalling. It seems that TGFβ2-dependent Smad2phosphorylation is significantly decreased in HT1080 cells that lack SDC2 (P ≤ 0.05).The co-localization and the regulation of the expression of TGFRIII, one of theTGFβ receptors, is another interesting quality of SDC2. In our study, we confirm theimportance of SDC2 in the regulation of TGFRIII expression (p ≤ 0.01) and suggestthat this proteoglycan participates in the presentation of TGFRIII on the cellmembrane.We also showed that SDC2 modulates the TGF-dependent expression (p ≤0.05) and activation (p ≤ 0.01) of FAK, as well as of integrin β1 (p ≤ 0.01), two genesthat are necessary for cell adhesion towards FN.Additionally, we studied the effect of HS chains on human fibrosarcoma cellfunctions. It is already known that HS chains can influence TGFβ-induced cellmotility. In order to proceed with these experiments, we used heparitinase, toachieve the specialized digestion of HS chains. This resulted in the formation of HSstubs. Interestingly, the otherwise TGFβ2-enhanced HT1080 cell adhesion wascompletely reversed after the addition of heparitinase and the shedding of HS chains(p ≤ 0.001). This outcome highlights the important role of HS chains on TGFβ2-induced cell adhesion.Furthermore, HS shedding inhibited TGFβ2-dependent Smad2 activation (p ≤0.001). The consequent down-regulation of the TGFβ2 signalling pathway explainsthe inhibitory effect of HS chains on ΤGFβ2-promoted HT1080 cell adhesion.Finally, the present PhD thesis studied the potential role of IGF-I infibrosarcoma progression. IGF-I is a known anabolic hormone, with provenoncogenic behaviour. Most of the downstream signalling is conducted through twomain signalling pathways: PI3K/AKT and MEK/ERK.While examining the effect of IGF-I on HT1080 cells, we reported aremarkable increase in cell migration, when cells were treated with IGF-I (p ≤ 0.001).SDC2 is abundant in fibrosarcoma and, as previously mentioned, SDC2 can regulatecell motility by changing actin cytoskeleton. Taking into account its unique abilities,we examined its possible participation in IGF-I pathways. The silencing of SDC2gene resulted interestingly in the inhibition of IGF-I induced HT1080 cell migration(p ≤ 0.001).Knowing that SDC2 can play the role of the co-receptor for several growthfactors, such as FGF and GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor), the next step was to examine whether SDC2 could be a co-receptor for IGF-Itoo. In the present study, we show for the first time that SDC2 is co-localized withIGF-IR, suggesting that SDC2 could be a co-receptor for IGF-I and subsequentlyaffect its bioavailability and downstream signalling.Next, we examined the participation of SDC2 in IGF-I signalling and cellmigration. As ERK1/2 is an important mediator of IGF-I signalling and affects cellmotility in various types of cancer, we tested the effect of SDC2 in IGF-I inducedERK1/2 activation. We show that SDC2 is essential for ERK1/2 phosphorylation (p ≤0.001) and we also show that ERK1/2 is essential for the IGF-I dependent HT1080cell migration (p ≤ 0.001). This could mean that SDC2 regulates IGF-Ι inducedmigration, at least partly through ERK1/2 activation and via the subsequentERK1/2-dependent gene transcription towards specific cell behaviours.Finally, we examined the putative role of ezrin, a protein-linker betweenreceptors of the cell membrane and actin cytoskeleton. It has been previously foundto be co-localized with SDC2 in filopodia of fibroblast-like cells. Interestingly, weshowed for the first time in our cells, that adding IGF-I to HT1080 cells leads toactivation of ezrin (p ≤ 0.001) and we confirmed that ezrin is co-localized with SDC2in ΗΤ1080 cells, making their lamellipodia more prominent. With these results, wepresent some of the mechanisms through which SDC2 participates in IGF-IdependentHT1080 cell migration.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των μηχανισμών λειτουργίας του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Πρόκειται για έναν σπάνιο όγκο βάσει της τελευταίας ιστολογικής ταξινόμησης, ο οποίος όμως, εμφανίζει πτωχή πρόγνωση. Το συγκεκριμένο σάρκωμα μαλακών μορίων προέρχεται από την κακοήθη εξαλλαγή των ινοβλαστών, κυττάρων που διαμορφώνουν τον εξωκυττάριο χώρο (ΕCM) και στηρίζουν τους ιστούς. Τα κύτταρα του ινοσαρκώματος είναι χαρακτηριστικά ατρακτοειδή, με επέκταση του προσθίου άκρου τους και μεγάλη κινητικότητα. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα του ινοσαρκώματος έχουν ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας του ECM. Πρόκειται για ένα περίπλοκο δίκτυο πρωτεογλυκανών, ινωδών πρωτεϊνών και υαλουρονικού οξέος, που υποστηρίζει και προστατεύει τα κύτταρα εντός των ιστών. Επιπλέον, ο ECM δημιουργεί και μεταφέρει πολλαπλά σύνθετα ερεθίσματα σε κύτταρα, επηρεάζοντας τη συμπεριφορά τους και τις βασικές τους λειτουργίες. Πράγματι, ο ECM είναι μια δεξαμενή αυξητικών παραγόντων,όπως ο αυξητικός παράγοντας του μετασχηματισμού (TGF), ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών 2 (FGF2), ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγοντας (IGF), αλλά και ενζύμων όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ουσίας (MMPs), οι συνθάσες, οι τρανσφεράσες και οι σουλφάσες, καθώς και άλλων μακρομορίων που ρυθμίζουν τη κυτταρική συμπεριφορά. Οι πρωτεογλυκάνες είναι μόρια που αποτελούνται από γλυκοζαμινογλυκανικές αλυσίδες (GAG), ομοιοπολικά συνδεδεμένες σε ένα πρωτεϊνικό κορμό και ταξινομούνται με βάση τις αλυσίδες τους σε πρωτεογλυκάνες θειϊκής κερατάνης (KSPGs), θειϊκής ηπαράνης (HSPGs), θειϊκής χονδροϊτίνης(CSPGs) και θειϊκής δερματάνης (DSPGs). Έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν τις κυτταρικές λειτουργίες και εν τέλει την πρόοδο ενός όγκου με διάφορους τρόπους.Την πολυδύναμη λειτουργικότητά τους την οφείλουν στη μοναδική τους μορφολογία, αλλά και τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίστανται από ένζυμα. Το αποτέλεσμα είναι διαφορετική εντόπιση, αποδόμηση, ανακύκλωση,αλληλεπίδραση με άλλα μακρομόρια (όπως αυξητικούς παράγοντες) και διαφορετική σηματοδότηση επί τα εντός και επί τα εκτός του κυττάρου. Οι πρωτεογλυκάνες έχουν ως ιδιαίτερο χαρακτηριστικό την άμεση επαφή με τον εξωκυττάριο χώρο και κατά συνέπεια τη μεταβίβαση των περιβαλλοντικών αλλαγών προς τα ενδότερα του κυττάρου, μεταφρασμένων πλέον ως ενδοκυττάρια σήματα.Η συνδεκάνη 2 (SDC2), μία πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης, είναι πολύ σημαντική για τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος (ΗΤ1080). Ένα μονοπάτι που επάγεται από τη SDC2,είναι το FAK (focal adhesion kinase)/PI3K (Phosphoinositide 3-kinase)/Rac (RasrelatedC3 botulinum toxin substrate 1), μέσω του οποίου αλλάζει τον κυτταροσκελετό της ακτίνης και κατά συνέπεια αυξάνει τη μετανάστευση των κυττάρων του ινοσαρκώματος ΗΤ1080. Ένας από του αυξητικούς παράγοντες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του ινοσαρκώματος είναι ο TGFβ2. Έχει καταγραφεί ότι ρυθμίζει την παραγωγή μορίων στον εξωκυττάριο χώρο, καθώς και τη διεισδυτικότητα και τη μετανάστευση των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε την ικανότητα του TGFβ2 να ενισχύει την προσκόλληση των κυττάρων ΗΤ1080 στην ινονεκτίνη (FN) (p ≤ 0.01), μία λειτουργία που σχετίζεται με την ικανότητα διείσδυσης ενός όγκου. Η επίδραση τουTGFβ2 στην ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων επηρεάζεται από την παρουσία της SDC2, καθώς τα ελλιπή σε SDC2 κύτταρα εμφανίζουν έντονη αναστολή τηςTGFβ2-εξαρτώμενης προσκόλλησης στην FN (p ≤ 0.01).Διαπιστώσαμε επίσης ότι η SDC2 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του Smad2, ενός κύριου διαμεσολαβητή της δράσης του TGFβ2. Φάνηκε ότι η απουσία της SDC2,οδηγεί σε σημαντική καταστολή της επαγόμενης από τον TGFβ2 φωσφορυλίωσης του Smad2 (p ≤ 0.05).Είναι γνωστό ότι η SDC2 εντοπίζεται μαζί με έναν από τους υποδοχείς τουTGF, τον TGFRIII. Παράλληλα, έχει βρεθεί ότι ελέγχει τόσο την παραγωγή τουTGFRIII, όσο και των TGFRI και II. Στη δική μας μελέτη επιβεβαιώσαμε την αναγκαιότητα της ύπαρξης της SDC2 για την έκφραση του TGFRIII (p ≤ 0.01) και προτείνουμε ότι η συγκεκριμένη πρωτεογλυκάνη ελέγχει την παρουσίαση τουTGFRIII στην κυτταρική μεμβράνη.Δείξαμε επίσης, ότι η SDC2 ελέγχει την εξαρτώμενη από τον ΤGF έκφραση (p≤ 0.05) και ενεργοποίηση (p ≤ 0.01) της FAK και της ιντεγκρίνης β1 (p ≤ 0.01), δύο γονιδίων απαραίτητων για την κυτταρική προσκόλληση στην FN.Στη συνέχεια μελετήσαμε τη σημασία των γλυκοζαμινογλυκανικών αλυσίδων θειϊκής ηπαράνης στις κυτταρικές λειτουργίες του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Έχει αποδειχθεί παλαιότερα ότι οι HS αλυσίδες επηρεάζουν την επαγόμενη από τονTGFβ κυτταρική κινητικότητα. Χρησιμοποιήσαμε την ηπαριτινάση για την ειδική πέψη των HS αλυσίδων δημιουργώντας ειδικούς επιτόπους (HS stubs). Με την αποκοπή των αλυσίδων HS, η προκαλούμενη από τον TGFβ2 προσκόλληση των ΗΤ1080 αναιρέθηκε σε μεγάλο βαθμό (p ≤ 0.001), αναδεικνύοντας την καίρια συμβολή των HS αλυσίδων στη συγκεκριμένη κυτταρική λειτουργία.Παράλληλα, η αποδόμηση των HS εμπόδισε την ενεργοποίηση του Smad2 από τον TGFβ2 (p ≤ 0.001). Η καταστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ2 θα μπορούσε να ερμηνεύσει την επίδραση των HS στην αναστολή της προσκόλλησης των ΗΤ1080 από τον TGFβ2. Τέλος, η παρούσα διατριβή διερευνά τον πιθανό ρόλο του IGF-I στην πρόοδο του ανθρώπινου ινοσαρκώματος. Πρόκειται για μία γνωστή αναβολική ορμόνη, με αποδεδειγμένες, ισχυρά ογκογόνες ιδιότητες. Για την πλειοψηφία των λειτουργιών που επιτελεί, σηματοδοτεί μέσω δύο κύριων μονοπατιών: του PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)/AKT (serine/threonine kinase) και του MAPK(mitogen-activated protein kinase)/ERK (extracellular signal-regulated kinases).Εξετάζοντας τη δράση του ΙGF-I στα κύτταρα ΗΤ1080, παρατηρήσαμε με ενδιαφέρον ότι ενισχύει σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων (p ≤ 0.001).Είναι γνωστό ότι η SDC2 , η οποία βρίσκεται σε αφθονία στο ινοσάρκωμα, έχει την ικανότητα να ρυθμίζει την κινητικότητα των κυττάρων διαμορφώνοντας τον κυτταροσκελετό. Έχοντας υπόψιν τις μοναδικές της ιδιότητες, διερευνήσαμε τη συμμετοχή της στις δράσεις του ΙGF-I. To αποτέλεσμα της καταστολής του γονιδίου της SDC2 ήταν να παρεμποδιστεί τελικά η εξαρτώμενη από τον IGF-I μετανάστευση των κυττάρων ΗΤ1080 (p ≤ 0.001).Γνωρίζοντας ότι η SDC2 διαδραματίζει το ρόλο του συν-υποδοχέα για διάφορους αυξητικούς παράγοντες [FGF (αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών),GM-CSF (αυξητικός παράγοντας διέγερσης αποικιών των κοκκιοκυττάρων), κτλ],εξετάσαμε το ενδεχόμενο ο IGF-IR να ανήκει σ’αυτήν την κατηγορία. Στην παρούσα διατριβή δείχνουμε για πρώτη φορά τη συνύπαρξη της SDC2 μαζί με τον IGF-IR,αναδεικνύοντας έτσι τη SDC2 ως πιθανό συν-υποδοχέα για τον ΙGF-I.Στην προσπάθειά μας να μελετήσουμε σε μεγαλύτερο βάθος τον τρόπο με τον οποίο η SDC2 επηρεάζει τη σηματοδότηση και κατά συνέπεια την κυτταρική μετανάστευση μέσω του IGF-I, εξετάσαμε την επίδραση της SDC2 στην ενεργοποίηση του ERK1/2. Διαπιστώσαμε ότι η SDC2 είναι απαραίτητη για τη φωσφορυλίωση τουERK1/2 (p ≤ 0.001), καθώς και ότι αντίστοιχα ο ERK1/2 είναι αναγκαίος για την επαγόμενη από τον IGF-I μετανάστευση των ΗΤ1080 (p ≤ 0.001). Τα αποτελέσματα αυτά πιθανώς σημαίνουν ότι ένας τρόπος με τον οποίο η SDC2 επηρεάζει την εξαρτώμενη από τον IGF-I μετανάστευση των ΗΤ1080 είναι η ενεργοποίηση του ΕRΚ1/2, η οποία είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τη μεταγραφή απαραίτητων γονιδίων για τη συμπεριφορά του κυττάρου.Τέλος, μελετήσαμε την ezrin, μια πρωτεΐνη που συνδέει μεμβρανικούς υποδοχείς με τον κυτταροσκελετό και έχει βρεθεί να εντοπίζεται συγκεκριμένα μαζί με τη SDC2 σε μικροπροσεκβολές κυττάρων ομοίων με τους ινοβλάστες. Αποτέλεσε ιδιαίτερα ενδιαφέρον εύρημα η αύξηση της ενεργοποίησης της ezrin (p ≤ 0.01) κατάχρονοεξαρτώμενο τρόπο, για πρώτη φορά στα κύτταρά μας, μετά την προσθήκη τουIGF-I. Παράλληλα, επιβεβαιώσαμε ότι η ezrin συνυπάρχει με τη SDC2, καθώς και με την ακτίνη στις έντονες μικροπροσεκβολές των κυττάρων ΗΤ1080, ρυθμίζοντας εν μέρει κατ’αυτόν τον τρόπο την κινητικότητα και την επιθετική συμπεριφορά των κυττάρων. Με τους παραπάνω μηχανισμούς, αναδεικνύεται σε σημαντικό βαθμό η δράση της SDC2 στην παθογένεια του ινοσαρκώματος και ιδιαίτερα η συμμετοχή της στη σηματοδότηση των αυξητικών παραγόντων TGFβ και IGF-I, που ρυθμίζουν την προσκόλληση και τη μετανάστευση αντίστοιχα, των κυττάρων του ανθρώπινου ινοσαρκώματος HT1080.