Απομόνωση και χαρακτηρισμός μεσεγχυματικών κυττάρων και μελέτη της επίδρασης βιοϋλικών και μικροπεριβάλλοντος στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση

Abstract

Stem cells display the unique property to replenish themselves through self-renewal and, also, to differentiate into specialized cells types and structures. There are two major groups in which the stem cells are divided; the embryonic stem cells (ESC), which are isolated from the inner mass of the blastocyst, and the adult stem cells (ASC), which are located in various tissues, such as bone marrow, adipose tissue and dental pulp. A subcategory of adult stem cells are the mesenchymal cells. The isolation and characterization of the mesenchymal stem cells (MSCs) remain, until today, a key point to their successful study and further use, since the minimal criteria to define human MSCs, as proposed by the International Society for Cellular Therapy in 2006, display certain limitations, due to the heterogeneity mesenchymal stem cells exhibit among them. In that way, it is essential to decree more thorough criteria of characterization, that will aid in the successful isolation of various mesenchymal stem cell populations.The mesenchymal stem cells from adult tissue have been isolated from various animal and human tissues in which they reside, cultured and characterized according to their morphological and biochemical features, and differentiated in vitro into specialized cells and tissues, in order to be used in the field of Regenerative Medicine. For instance, mesenchymal stem cells derived from dental tissue have been applied in fields of Dental Tissue Engineering, aiming mostly to the regeneration of the dental tissue. These (sub)populations can be grouped in the following categories: a) stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHEDs; b) periodontal ligament stem cells, PDLSCs; c) dental pulp stem cells, DPSCs; and d) stem cells from the dental apical papilla, SCAPs. These (sub)populations have been successfully isolated and used in various applications ex vivo and in vivo, through the employment of scaffolds that can, potentially, drive the creation of dentine and pulp tissue. Another important factor in the equation is the in vitro biocompatibility of the mesenchymal stem cells with several biomaterials, which are applied extensively during the repair of damaged tissue. Such biomaterials used in Endodontics are ΜΤΑ (Mineral Trioxide Aggregate), in the forms of MTA Angelus and ProRoot MTA, Bio-Oss® and Super-EBA. Biocompatibility of the mesenchymal stem cells, along with their ability to adhere and proliferate at their presence, poses as one of the landmarks in Regenerative Tissue Engineering and its applications in vivo.Regeneration and / or tissue healing through the introduction of stem cells in an organism premise their ability to differentiate and to proliferate. The loss of their mesenchymal nature must be tightly regulated, in such a way that the differentiated and specialized structures created will not pose any danger to the organism. The ability of mesenchymal stem cells to migrate and settle in tumors, influencing the surrounding environment, either by stimulatory or inhibitory effects, and, also, their invasive capabilities leading to metastasis, have drawn, lately, the attention of the scientific community. For instance, mesenchymal stem cells have been known to affect the tumor environment and tumor formation, by activating the epithelial to mesenchymal transition (EMT) phenomenon of the cells through the triggering of multiple molecular mechanisms. The scope of this study was to successfully isolate and characterize certain (sub)populations of mesenchymal stem cells, to recognize the (sub)population that displays the most stemness features, in order to study the association of mesenchymal stem cells’ development and differentiation with the effects of biomaterials as attachment scaffolds, routinely used in Endodontics, and, ultimately, to illuminate their potential role in cancer. The mesenchymal stem cells (sub)populations, herein, studied were adipose – derived stem cells, ADSCs; mesenchymal stem cells from umbilical cord, hUCMSCs; stem cells from human exfoliated teeth, SHEDs; and stem cells from periodontal ligament, PDLSCs. These (sub)populations have been isolated through enzymatic processes and cultured in plastic dishes, in order to assess their ability to adhere and proliferate in plastic, as well as to identify their typical morphologic and molecular features, such as the expression of various markers on their surfaces (CD molecules), through FACS, and their efficiency to differentiate into osteoblasts, chondroblasts and adipose tissues in vitro. Remarkably, they have sufficiently displayed all the mesenchymal stem cell properties, in general. However, the various mesenchymal stem cell subpopulations exhibit differences among them, such as diversities in their proliferative potential or in the expression of surface markers, whereas the dental stem cell (sub)populations display, in general, the best mesenchymal features, which led us to focus our study on these (sub)populations. Thus, we explored the proliferative potential of SHEDs και PDLSCs, their expression profile of multiple surface markers and their ability to migrate through a wound – healing assay, while we also conducted deep proteome profile identification through the state-of-the-art proteomic technology of nano – LC-MS/MS (liquid chromatography/tandem-mass-spectrometry). Through these experiments, it became evident that PDLSCs carry higher proliferative potential, when compared to SHEDs, whereas SHEDs have a better migratory capacity and higher expression of most of the molecular surface markers that were examined, except for CD13. Additionally, through the innovative proteomic technology nano – LC-MS/MS, a detailed proteomic landscape of SHEDs and PDLSCs was mapped, revealing 2,032 identified proteins in SHEDs and 3,235 ones in PDLSCs. Between the commonly identified proteins of SHEDs and PDLSCs, there are stem cell-specific markers, cytoskeletal elements and proteins controlling major metabolic pathways. By elucidating the differences of expressed molecules between these stem cell (sub)populations, we suggest that SHEDs seem to be more actively specialized in cellular plasticity, migration, adhesion and signal transduction, whereas PDLSCs are more metabolically “addicted” cells and express a number of proteins implicated in cell cycle. This full proteome mapping achieved in the present study could lead to the creation of dental stem cell banks, since these cells display excellent features, are well characterized and are isolated from a tissue, which is rejected from the human body and discarded. The mesenchymal cells were further differentiated into specialized cell types and their ability to differentiate was evaluated through the expression of genes implicated in the early or late stages of differentiation. More specifically, SHEDs express, in general, early genes of adipogenesis and chondrogenesis, and genes activated later in the osteogenesis process, suggesting, thus, that SHEDs may be a more “primitive” mesenchymal stem cell population. In this context, SHEDs were the major (sub)population that we used to study the differentiation and developmental potential in the presence of the biomaterials ΜΤΑ, Bio-Oss® and dentin chips, in a set of different experiments, from which the following observations were made: a) SHEDs can develop better in the presence of dentin chips and ΜΤΑ; b) in general, the cells have the ability to proliferate in the presence of all biomaterial scaffolds and to generate stress fibers; c) in the presence of Bio-Oss®, aggregates are formed and the cellular morphology is altered; and d) SHEDs tend to be attracted and migrate towards dentin chips. The differentiation potential in the presence of biomaterials was also studied, and Bio-Oss® was found to induce more strongly the osteogenic process compared to the rest biomaterials, since, in the presence of Bio-Oss®, cells overexpressed late osteoblast genes, whereas in the presence of ΜΤΑ, there was no detectable expression of early osteoblast genes. Dentin chips significantly contributed to induced osteogenesis, by activation of gene expression of lineage – specific transcription factors, such as Runx2 and Osterix. Based on these observations, we believe that dentin chips could contribute greatly to the in vivo tissue repair, and we propose the production of a biomaterial with core component the dentin chips. In the last part of our study, we explored molecular mechanisms, through which the mesenchymal stem cells may be implicated in tumorigenesis, focusing on CCDC6, an evolutionary conserved protein, encoded by the gene Coiled-Coil Domain Containing 6, Ccdc6. Ccdc6 was isolated and characterized due to its implication in a chromosomal rearrangement observed in 20% of thyroid papillary carcinoma patients, while it often creates chimeric genes that are tightly associated with neoplastic events, such as thyroid cancer and leukemia. Interestingly, Ccdc6 is considered to play a major role in cell cycle control, genomic stability maintenance and cellular survival. To evaluate its role in the physiology of mesenchymal stem cells, we, herein, studied the normal and pathological topology of CCDC6 in SHEDs and PDLSCs, and the effects of its loss of expression in the phenotype of examined cells, molecular pathway functions and proliferative potential. In SHEDs, loss of CCDC6 expression leads to a dramatic downregulation of the endogenous levels of α- and γ-tubulin, and different expression profile of vimentin, a major mesenchymal regulator / marker. At the same time, loss of CCDC6 seems to target α-tubulin towards the microtubule-organizing center (MTOC) of the cell and to induce differentiation of SHEDs towards a more epithelial phenotype, while the cells that retain the fibroblast-like spindle shape display larger cell size than normal. Lastly, the proliferative potential of the cells is reduced by increased expression of the proteins p21, p-Cdc2 and p-Chk1. Overexpression of CCDC6 creates a diffused distribution pattern of the protein, whereas overexpression of its mutant form that carries the point mutation S351A results in a diffused topology and perinuclear localization. CCDC6 is also, herein, proved to be phosphorylated by the Akt serine / threonine kinase at the critical amino acid residue S351. All the above data, strongly indicate that the protein CCDC6 presents features of an Akt target substrate, is critically implicated in microtubule dynamics and essentially regulates cell cycle progression in mesenchymal stem cells.

Τα κύτταρα, για να χαρακτηριστούν βλαστικά, πρέπει να παρουσιάζουν δύο ιδιότητες: την ικανότητα διαφοροποίησης προς ποικίλους κυτταρικούς τύπους και την δυνατότητα αυτο-ανανέωσης, πολλαπλασιασμού, δηλαδή, προς όμοια κύτταρα. Οι δύο βασικοί τύποι βλαστικών κυττάρων που έχουν περιγραφεί είναι τα εμβρυ(ον)ικά βλαστικά κύτταρα (ESCs {Embryonic Stem Cells}), που απομονώνονται από την εσωτερική μάζα της βλαστοκύστης και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα (ADSs {Adult Stem Cells}), στα οποία συμπεριλαμβάνονται και τα μεσεγχυματικά κύτταρα, και τα οποία απομονώνονται από διάφορους ιστούς, όπως ομφάλιος λώρος, λίπος και δόντια. Η διαδικασία της απομόνωσης και του χαρακτηρισμού των μεσεγχυματικών κυττάρων αποτελεί, ακόμα και σήμερα, σημείο – κλειδί για την επιτυχημένη μελέτη και χρήση τους, καθώς τα κριτήρια που θέσπισε, το 2006, ο Διεθνής Οργανισμός Κυτταρικής Θεραπείας (ISCT {International Society for Cellular Therapy}) για την αναγνώριση και κατηγοριοποίηση των πληθυσμών τους, δεν επαρκούν για τον πλήρη χαρακτηρισμό τους, λόγω της μεγάλης ετερογένειας που εμφανίζουν. Για το λόγο αυτό, είναι σημαντικό να θεσπιστούν συνεπικουρικά κριτήρια αναγνώρισης και χαρακτηρισμού των μεσεγχυματικών κυττάρων, που θα συντελέσουν στην καθολική αποδοχή των γενικών χαρακτηριστικών των πληθυσμών τους και, άρα, και στην άμεση χρήση τους.Τα μεσεγχυματικά κύτταρα ενηλίκων έχουν απομονωθεί επιτυχώς από πληθώρα ανθρώπινων και ζωϊκών ιστών στους οποίους εδράζονται, έχουν καλλιεργηθεί και χαρακτηριστεί με βάση τα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, και έχουν διαφοροποιηθεί in vitro προς εξειδικευμένους κυτταρικούς πληθυσμούς, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στην Αναγεννητική Ιατρική. Χαρακτηριστικό παράδειγμα μεσεγχυματικών κυττάρων που έχουν εκτενώς μελετηθεί, με σκοπό να χρησιμοποιηθούν στον κλάδο της Αναγεννητικής Ενδοδοντολογίας, προς αναγέννηση ή ανάπλαση του οδοντικού ιστού, αποτελούν οι πληθυσμοί που ανευρίσκονται στον οδοντικό ιστό, στους οποίους συμπεριλαμβάνονται οι εξής υποπληθυσμοί: α) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό νεογιλών δοντιών (Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth, SHEDs), β) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό ενήλικων δοντιών (Dental Pulp Stem Cells, DPSCs), γ) Μεσεγχυματικά κύτταρα από τον περιοδοντικό σύνδεσμο (Periodontal Ligament Stem Cells, PDLSCs), και δ) Μεσεγχυματικά κύτταρα από την οδοντική θηλή (Stem Cells from the Apical Papilla, SCAPs). Οι παραπάνω υποπληθυσμοί έχουν καλλιεργηθεί επιτυχώς και έχει γίνει προσπάθεια ex vivo και in vivo εφαρμογής τους, μέσω χρήσης κατάλληλων ικριωμάτων, προκειμένου της δημιουργίας οδοντίνης και πολφοειδούς ιστού. Ταυτόχρονα, σημαντικό ρόλο διαδραματίζει η συμβατότητά τους με βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται εκτενώς κατά την επιδιόρθωση ή / και αποκατάσταση τραυματισμών. Χαρακτηριστικά βιοϋλικά που χρησιμοποιούνται στην Ενδοδοντολογία είναι το ΜΤΑ (Mineral Trioxide Aggregate), που ευρίσκεται σε διάφορες μορφές στο εμπόριο, όπως τα MTA Angelus και ProRoot MTA, το Bio-Oss® και το Super-EBA βιοϋλικό. Η συμβατότητα των κυττάρων με τα διάφορα βιοϋλικά, αλλά και η ικανότητα προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού τους παρουσία αυτών, αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά σημεία στην Αναγεννητική Ενδοδοντολογία για την επιτυχημένη εφαρμογής τους in vivo. Η επούλωση ή αναγέννηση ενός ιστού, που πραγματοποιείται μέσω της εισαγωγής μεσεγχυματικών κυττάρων, προϋποθέτει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό τους. Έτσι, είναι φανερό, ότι το αναπτυξιακό πρότυπο με το οποίο τα κύτταρα αυτά χάνουν το μεσεγχυματικό τους χαρακτήρα και υπεισέρχονται σε κατάσταση διαφοροποίησης πρέπει να ελέγχεται προσεκτικά, ώστε να δημιουργούνται εξειδικευμένα κύτταρα και ιστοί οι οποίοι δε θα αποτελούν κίνδυνο για τον οργανισμό. Τα τελευταία χρόνια, αναφέρεται ολοένα και περισσότερο η ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων να μεταναστεύουν και να εγκαθίστανται σε καρκινικούς όγκους, όπου επάγουν διεγερτικές ή ανασταλτικές αποκρίσεις στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, αλλά και στην ικανότητά τους για διήθηση σε ιστούς και μετάσταση, μέσω είτε έμμεσων είτε άμεσων αλληλεπιδράσεων με τα καρκινικά κύτταρα. Για παράδειγμα, τα μεσεγχυματικά κύτταρα μπορούν να επηρεάζουν το περιβάλλον του ιστού στον οποίο βρίσκονται, ενισχύοντας τον σχηματισμό όγκων και ρυθμίζοντας την επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ: Epithelial to Mesenchymal Transition) των καρκινικών κυττάρων, μέσω ενεργοποίησης μηχανισμών αποδιαφοροποίησης. Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η επιτυχής απομόνωση και ο πλήρης χαρακτηρισμός διάφορων (υπο)πληθυσμών μεσεγχυματικών κυττάρων, εν συνεχεία, η επιλογή του (υπο)πληθυσμού που συγκεντρώνει τα περισσότερο μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά προς in vitro ανάπτυξη και διαφοροποίησή του παρουσία βιοϋλικών Ενδοδοντολογίας, καθώς και η μελέτη του ρόλου που διαδραματίζουν οι απομονωμένοι (υπο)πληθυσμοί μεσεγχυματικών κυττάρων σε γεγονότα καρκινογένεσης.Οι (υπο)πληθυσμοί των μεσεγχυματικών κυττάρων που μελετήθηκαν ήταν μεσεγχυματικά κύτταρα από το λιπώδη ιστό (ADSCs {Adipose – Derived Stem Cells}), μεσεγχυματικά κύτταρα από τη γέλη του Wharton (hUCMSCs {Mesenchymal Stem Cells from Umbilical Cord}), μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό πολφό νεογιλών δοντιών (SHEDs {Stem Cells from Human Exfoliated Teeth}) και μεσεγχυματικά κύτταρα από τον περιοδοντικό σύνδεσμο (PDLSCs {Stem Cells from Periodontal Ligament}). Τα κύτταρα αυτά απομονώθηκαν με ενζυμ(ατ)ικές μεθόδους, καλλιεργήθηκαν σε πλαστικές επιφάνειες για την εκτίμηση της ικανότητας προσκόλλησης και πολλαπλασιασμού τους, καθώς και των τυπικών μορφολογικών χαρακτηριστικών τους, και αναλύθηκαν μέσω Κυτταρομετρίας Ροής ως προς τους μοριακούς δείκτες επιφάνειας που εκφράζουν, ενώ συγχρόνως προσδιορίστηκε και η ικανότητα in vitro διαφοροποίησής τους προς οστεοβλάστες, λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα, όπου κατέστη φανερό ότι όλοι οι (υπο)πληθυσμοί που μελετήθηκαν εμφάνιζαν τα χαρακτηριστικά των μεσεγχυματικών κυττάρων σε ικανοποιητικό βαθμό. Εντούτοις, οι διαφορές που εντοπίστηκαν ανάμεσά τους, όπως για παράδειγμα το διαφορικό δυναμικό πολλαπλασιασμού ή η ποσοστιαία έκφραση μοριακών δεικτών, μας οδήγησε να εστιάσουμε στα μεσεγχυματικά κύτταρα από τον οδοντικό ιστό. Έτσι, εν συνεχεία, διερευνήσθηκε το δυναμικό πολλαπλασιασμού των μεσεγχυματικών κυττάρων SHEDs και PDLSCs, το μοριακό προφίλ έκφρασης μίας πλειάδας δεικτών επιφάνειας, και η ικανότητα «επούλωσης πληγής» τους, ενώ πραγματοποιήθηκε ένας, εις βάθους, χαρακτηρισμός του πρωτεϊνικού περιεχομένου τους, μέσω υγρής χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας, τύπου nano-LC-MS/MS. Με τις παραπάνω τεχνικές, παρατηρήθηκε, ότι ενώ τα PDLSCs εμφανίζουν υψηλότερο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, τα SHEDs φαίνεται να διαθέτουν υψηλότερη μεταναστευτική ικανότητα και να εκφράζουν σε υψηλότερα ποσοστά όλους τους μοριακούς δείκτες αναγνώρισης μεσεγχυματικών κυττάρων, πλην του δείκτη CD13. Επίσης, μέσω της πρωτεωμικής τεχνολογίας nano-LC-MS/MS αναγνωρίστηκε, για πρώτη φορά, ένας εξαιρετικά υψηλός αριθμός πρωτεϊνικού περιεχομένου των κυττάρων αυτών, και συγκεκριμένα 2.032 πρωτεΐνες στα κύτταρα SHEDs και 3.235 στα PDLSCs. Ανάμεσά τους βρίσκονται πρωτεΐνες χαρακτηριστικές των μεσεγχυματικών κυττάρων, αλλά και πλήθος κοινών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταροσκελετό και τον ενεργειακό μεταβολισμό. Έπειτα από ανάλυση των δεδομένων, προκύπτει ότι τα κύτταρα SHEDs εξειδικεύονται σε γεγονότα κυτταρικής πλαστικότητας, μετανάστευσης, προσκόλλησης και μεταγωγής σήματος, ενώ τα PDLSCs είναι περισσότερο μεταβολικά ενεργά κύτταρα, και περιέχουν μεγάλο αριθμό επιπλέον πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο. Ο πλήρης πρωτεωμικός χαρακτηρισμός των κυττάρων αυτών, που επιτεύχθηκε στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, θα μπορούσε να συντελέσει στη δημιουργία τράπεζας μεσεγχυματικών κυττάρων από οδοντικό ιστό, καθώς τα κύτταρα αυτά διαφαίνεται ότι παρουσιάζουν άριστα χαρακτηριστικά και λειτουργίες, είναι πολύ καλά χαρακτηρισμένα, και προέρχονται από ιστό ο οποίος απορρίπτεται φυσιολογικά από το ανθρώπινο σώμα.Έπειτα από τον πλήρη χαρακτηρισμό και την αναγνώριση σχεδόν του συνόλου των πρωτεϊνών που εκφράζονται από τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs και PDLSCs, πραγματοποιήθηκε διαφοροποίησή τους προς εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους, και εκτίμηση της έκφρασης μορίων – δεικτών που σχετίζονται με τα επίπεδα της διαφοροποίησης των μεσεγχυματικών κυττάρων αυτών, από όπου και προέκυψε ότι τα κύτταρα SHEDs εκφράζουν, γενικότερα, πιο πρώϊμους δείκτες διαφοροποίησης προς λιποκύτταρα και χονδροκύτταρα, και πιο ώριμους δείκτες για οστεοβλάστες, και πιθανόν αποτελούν πιο «προγονικό» πληθυσμό μεσεγχυματικών κυττάρων. Έτσι, τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs αποτέλεσαν τον κύριο πληθυσμό στον οποίο μελετήθηκε η ικανότητα διαφοροποίησης και ανάπτυξής τους, παρουσία των βιοϋλικών τύπου ΜΤΑ, Bio-Oss® και ρινισμάτων οδοντίνης, σε διάφορους πειραματικούς σχεδιασμούς, από όπου προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: α) τα μεσεγχυματικά κύτταρα SHEDs αναπτύσσονται καλύτερα επί των ρινισμάτων οδοντίνης και του ΜΤΑ, β) τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται επί της επιφάνειας όλων των μελετηθέντων υλικών και να αποκτούν αποφυάδες τύπου «ινίδια στρες», γ) το Bio-Oss® προκαλεί τη δημιουργία συσσωματωμάτων και αλλαγή στη μορφολογία των κυττάρων, και δ) καλύτερη προσέλκυση και μετανάστευση των SHEDs επάγουν τα ρινίσματα οδοντίνης. Ταυτόχρονα, μελετήθηκε και η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων, παρουσία των εν λόγω βιοϋλικών, όπου παρατηρήθηκε ότι το Bio-Oss® εμφανίζει τις καλύτερες ιδιότητες επαγωγής οστεογένεσης, αφού, παρουσία του, τα κύτταρα υπερεκφράζουν δείκτες ώριμων οστεοβλαστών, ενώ παρουσία ΜΤΑ δεν ανιχνεύτηκε η έκφραση πρώϊμων δεικτών οστεογένεσης. Τα ρινίσματα οδοντίνης, τέλος, πιθανόν να συνδράμουν περισσότερο στην επαγόμενη οστεογένεση, αυξάνοντας την έκφραση γονιδίων δεικτών, όπως είναι οι μεταγραφικοί παράγοντες Runx2 και Osterix. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, προτείνεται η δημιουργία ενός βιοϋλικού με βασικό συστατικό τα ρινίσματα οδοντίνης, καθώς αυτό θα μπορούσε να συνεισφέρει σημαντικά στην επιδιόρθωση του οδοντικού ιστού in vivo.Στο τελευταίο κομμάτι της Διδακτορικής Διατριβής, θελήσαμε να εστιάσουμε σε μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους, πιθανόν, τα μεσεγχυματικά κύτταρα να εμπλέκονται σε διαδικασίες ογκογένεσης, και έτσι επικεντρωθήκαμε στην πρωτεΐνη CCDC6, μία καλά συντηρημένη, εξελικτικά, πρωτεΐνη, η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο Coiled-Coil Domain Containing 6, Ccdc6. Η πρωτεΐνη CCDC6 απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε λόγω της εμπλοκής της σε μία παρακεντρική χρωμοσωμική αναστροφή που παρατηρείται, σε ποσοστό της τάξης του 20%, σε ασθενείς με θηλωματώδες καρκίνωμα του θυρεοειδούς αδένα, ενώ συχνά συμμετέχει στη δημιουργία χιμαιρικών (υβριδικών) γονιδίων, τα οποία συνδέονται με την εκδήλωση νεοπλασίας, όπως είναι ο καρκίνος του θυρεοειδούς αδένα και οι λευχαιμίες, και θεωρείται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, στη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας και στην επιβίωση των κυττάρων. Στο πλαίσιο αυτό, μελετήθηκε η κατανομή της CCDC6 (φυσιολογικής ή μη) στα κύτταρα SHEDs και PDLSCs, καθώς και η επίδραση που έχει η απώλεια της φυσιολογικής έκφρασής της στο «μορφο-φαινότυπο» των κυττάρων, σε ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος και στο δυναμικό πολλαπλασιασμού αυτών. Συμπερασματικά, φαίνεται ότι έλλειψη της CCDC6 επιφέρει δραματική μείωση των επιπέδων α- και γ-τουμπουλίνης στα SHEDs, και αλλαγή προτύπου κατανομής και έκφρασης βιμεντίνης (κύριος μεσεγχυματικός δείκτης και ρυθμιστής). Επίσης, έλλειψη της CCDC6 επάγει διαφοροποίηση των SHEDs, τα οποία παρουσιάζουν ημι-πεπλατυσμένο σχήμα με ελάφρυνση των ατρακτοειδών (ινοβλαστικών) στοιχείων στο χώρο, ενώ όσα διατηρούν τη μορφολογία τύπου ινοβλάστη εμφανίζουν πολύ μεγαλύτερο μέγεθος, και συγχρόνως προκαλεί επιβράδυνση στο πολλαπλασιαστικό δυναμικό, μέσω αύξησης επιπέδων των p21, p-Cdc2 και p-Chk1 πρωτεϊνών. Στον αντίποδα, υπερέκφραση της CCDC6, σχετίζεται, κυρίως, με ένα διάχυτο πρότυπο κατανομής της στον κυτταροσκελετό των SHED κυττάρων, ενώ η έκφραση της μεταλλαγμένης μορφής αυτής, φέρουσα τη σημειακή μεταλλαγή S351A, εμφανίζει ταυτόχρονα διάχυτη και εντοπισμένη περιπυρηνικά κατανομή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το εύρημα, ότι η πρωτεΐνη CCDC6 φαίνεται να φωσφορυλιώνεται από την κινάση σερίνης / θρεονίνης Akt. Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι η πρωτεΐνη CCDC6 παρουσιάζει χαρακτηριστικά Akt πρωτεΐνης στόχου, είναι απαραίτητη για τη συγκρότηση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και παίζει καθοριστικό ρόλο στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στα μεσεγχυματικά κύτταρα