Το ουδετερόφιλο ως συνένοχος στη συνομιλία φλεγμονής - καρκίνου: μελέτη σε περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος παχέος εντέρου

Abstract

Inflammation is a hallmark of colorectal cancer (CRC). Neutrophils are well-known mediators in tumor biology, but their role in solid tumors, including CRC, was redefined by neutrophil extracellular traps (NETs). Since NETs have been recently implicated in cancer metastasis and cancer associated thrombosis, but they have never been studied in colon cancer, we sought to determine their presence in colonic adenocarcinomas and metastatic lymph nodes and to further investigate their potential role in cancer biology. Furthermore, since Tissue Factor (TF) has been implicated in cancer biology and demonstrated on NETs in other disorders, we investigated its presence. Based on the above data and on a recent study demonstrating that platelet-derived polyP primes neutrophils to release NETs, we examined the same surgical specimens from CRC to investigate the presence of polyP, as a possible NET inducer. Biopsies with adenomas, hyperplastic polyps, inflammatory bowel disease and healthy colon tissues were used as controls. In all cases, the presence of polyP was apparent, with the main source of polyP being the mast cells. Colectomy specimens and variable number of draining lymph nodes were obtained from ten patients with adenocarcinoma of the colon. NETs deposition and neutrophil presence as well as TF expression were examined by immunostaining. The effect of NETs on cancer cell growth was studied in in vitro co-cultures of Caco-2 cell line and acute myeloid leukemia primary cells. Proliferation and apoptosis/necrosis of cancer cells were analyzed by flow cytometry.TF-bearing NETs and neutrophil localization were prominent in tumor sections and the respective metastatic lymph nodes. Interestingly, neutrophil infiltration and NETs concentration were gradually reduced from the tumor mass to the distal margin. Finally, the in vitro-generated NETs impeded growth of cancer cell cultures by directly inducing apoptosis and inhibiting proliferation.Based on the above data and on a recent study demonstrating that platelet-derived polyP primes neutrophils to release NETs, we examined the same surgical specimens from CRC to investigate the presence of polyP, as a possible NET inducer. Biopsies with adenomas, hyperplastic polyps, inflammatory bowel disease and healthy colon tissues were used as controls. In all cases, the presence of polyP was apparent, with the main source of polyP being the mast cells. In all CRC and all adenomas with high-grade dysplasia, a substantial number of mast cells, more than 50%, co-expressed intracellularly polyP with CD68 surface antigen (CD68+), but this was not the case in the other examined disorders. PolyP-expressing mast cells were detected in close proximity with tumor cells and neutrophils, suggesting polyP expression by CD68+ mast cells among the stimuli which prime neutrophils to release NETs, in CRC. Moreover, the detection of CD68+ polyP-expressing mast cells could represent a potential prognostic marker in colorectal adenomas and/or carcinomas.These data support further the role of neutrophils and NETs in cancer biology suggesting a possible inhibitory effect on cancer cell growth. Moreover, they reveal a possible interplay between neutrophils and mast cells in CRC.

Η φλεγμονή είναι άμεσα συνδεδεμένη με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του παχέος εντέρου, και έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών. Ωστόσο, ο ρόλος των ουδετερόφιλων παραμένει αρκετά ασαφής, αν και κάποιες πρόσφατες μελέτες, τον έχουν επαναπροσδιορίσει, εμπλέκοντας τα εξωκυττάρια ουδετεροφιλικά δίκτυα χρωματίνης (neutrophil extracellular traps/NETs) τόσο στη μετάσταση, όσο και στη θρόμβωση τη σχετιζόμενη με τον καρκίνο. Καθώς οι δομές αυτές δεν έχουν μελετηθεί στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, έναν από τους συχνότερους κακοήθεις όγκους, αρχικά διερευνήθηκε η παρουσία τους σε αυτή τη μορφή καρκίνου και στη συνέχεια μελετήθηκε η πιθανή αλληλεπίδραση τους με τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, μελετήθηκε η παρουσία του ιστικού παράγοντα (tissue factor/TF), δεδομένου ότι κατέχει σημαντικό ρόλο στη βιολογία του καρκίνου, ενώ έχουν αναφερθεί καταστάσεις, στις οποίες συσχετίζεται με τα NETs.Στην πρώτη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάσματα παχέος εντέρου, συμπεριλαμβανομένων και των επιχώριων λεμφαδένων, από δέκα ασθενείς με τη διάγνωση αδενοκαρκινώματος, με σκοπό να διερευνηθούν, με τη μέθοδο του ανοσοφθορισμού και της ανοσοϊστοχημείας, οι εναποθέσεις ουδετερόφιλων, NETs και TF. Η παρουσία NETs με έκφραση TF ήταν αξιοσημείωτη στις τομές του όγκου και στους επιχώριους μεταστατικούς λεμφαδένες, ενώ ανάλογη ήταν και η παρουσία ουδετερόφιλων. Χαρακτηριστική, όμως, ήταν η διαβάθμιση που παρουσιάζε η ουδετεροφιλική διήθηση, αλλά και η συγκέντρωση των NETs, καθώς αμφότερες μειώνονταν σταδιακά, όσο αυξανόταν η απόσταση από τον όγκο, μέχρι την πλήρη απουσία τους στο χειρουργικό όριο εκτομής. Βασιζόμενοι στα παραπάνω in situ ευρήματα, μελετήθηκε η επίδραση των NETs στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε in vitro συγκαλλιέργειες α) καρκινικής κυτταρικής σειράς παχέος εντέρου (Caco-2) με NETs ή με ουδετερόφιλα και β) πρωτογενών κυττάρων οξείας μυελογενούς λευχαιμίας με NETs ή με ουδετερόφιλα. Και στις δυο περιπτώσεις, παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων από τα in vitro διεγερμένα NETs, τα οποία προκαλούν αναστολή του πολλαπλασιασμού ή επάγουν την απόπτωση, όπως διαπιστώθηκε με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής.Με την ολοκλήρωση της πρώτης μελέτης, όπου σε περιστατικά αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου παρατηρήθηκε εκτεταμένη παρουσία εξωκυττάριων ουδετεροφιλικών δικτύων χρωματίνης, το ενδιαφέρον στράφηκε στο τι θα μπορούσε να αποτελεί το έναυσμα για την παραγωγή NETs. Με αφορμή τη μελέτη του Εργαστηρίου Μοριακής Αιματολογίας, ΔΠΘ, όπου τα αιμοπετάλια σε θρομβωτικές καταστάσεις όταν εκφράζουν ανόργανα πολυφωσφορικά (inorganic polyphosphate/polyP) διεγείρουν τα ουδετερόφιλα να παράγουν NETs, διερευνήθηκε στα ίδια περιστατικά αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου η παρουσία πολυφωσφορικών, ως ένας πιθανός επαγωγέας της ΝΕΤωσης.Τα polyP είναι πολυμερή μόρια σε γραμμική διάταξη, με την αλυσίδα τους να συντίθεται από πολυάριθμες ορθοφωσφορικές μονάδες, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με υψηλής ενέργειας δεσμούς φωσφορικού ανυδρίτη. Ανευρίσκονται σε ποικιλία οργανισμών (από τα βακτήρια μέχρι τον άνθρωπο) και μπορεί το μήκος τους να ποικίλλει, όχι μόνο από οργανισμό σε οργανισμό, αλλά και στον ίδιο οργανισμό από ιστό σε ιστό. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι σε κύτταρα θηλαστικών, τα polyP εμπλέκονται σε διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, όπως για παράδειγμα στο μεταβολισμό ενέργειας, στην ανάπτυξη και την απόπτωση κυττάρων, τη θρόμβωση, την αγγειογένεση, τη φλεγμονή και τη μετάσταση σε κακοήθεις καταστάσεις. Όσον αφορά τον καρκίνο, τα polyP έχουν συσχετισθεί με συμπαγείς όγκους, αλλά ο ρόλος τους στην βιολογία του καρκίνου παραμένει άγνωστος.Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες, βιοψίες από αδενωματώδεις πολύποδες παχέος εντέρου με υψηλόβαθμη και χαμηλόβαθμη δυσπλασία του επιθηλίου, από υπερπλαστικούς πολύποδες, βιοψίες με διάγνωση ελκώδους κολίτιδας ή νόσου Crohn, και βιοψίες παχέος εντέρου με φυσιολογικό βλεννογόνο. Σε όλες τις περιπτώσεις, η παρουσία των polyP ήταν εμφανής, με τα σιτευτικά κύτταρα να αποτελούν τη βασική πηγή προέλευσής τους. Επιπλέον, ιδιαίτερα ενδιαφέρον ήταν το γεγονός, ότι σε όλα τα περιστατικά αδενοκαρκινώματος και αδενωμάτων με υψηλόβαθμη δυσπλασία του επιθηλίου, ένας σημαντικός αριθμός σιτευτικών κυττάρων, μεγαλύτερος από 50%, παρουσίαζαν συνέκφραση polyP και CD68 (CD68+), εύρημα το οποίο απουσίαζε σε όλες τις υπόλοιπες καταστάσεις. Επιπλέον, τα κύτταρα που εκφράζουν polyP είναι σε γειτνίαση με τα νεοπλασματικά κύτταρα και τα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα.Συμπερασματικά, τα κύτταρα που εκφράζουν polyP θα μπορούσαν να αποτελούν πιθανό ερέθισμα των ουδετερόφιλων ώστε να απελευθερώσουν NETs. Επιπλέον, καθώς τα CD68+ σιτευτικά κύτταρα εντοπίζονται σχεδόν αποκλειστικά στα αδενώματα και το αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου, θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν έναν πιθανό προγνωστικό δείκτη για αυτές τις καταστάσεις.Τα αποτελέσματα των δύο μελετών δίνουν έμφαση στη σχέση που υπάρχει μεταξύ καρκίνου και φλεγμονής. Ο ρόλος των ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων λευκοκυττάρων και των NETs στη βιολογία του καρκίνου ενισχύεται, ενώ παράλληλα αναδεικνύεται μία πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ ουδετερόφιλων και σιτευτικών κυττάρων.