Μελέτη της έκφρασης γονιδίων κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου του ποντικού

Abstract

In past 20 years a lot of effort has been put in order to understand the molecular and cellular mechanisms underlying the development, the function and the aging of the nervous system. Apart from the scientific interest, the unravelling of these mechanisms is of paramount importance for the understanding of the pathophysiology of the neural disorders as well as for the development of therapeutic approaches.The aim of this study was both to characterize novel genes that are expressed in the developing nervous system of the mouse as well as to study their expression pattern during development.In order to characterize novel genes expressed in the developing nervous system of the mouse we exploited the data from two databases, namely the Genepaint and the Allen Brain. Both databases contain a collection of expression patterns at E14.5 developmental stage. Moreover, Allen Brain contains also expression data patterns of the adult brain. Using correlation studies we analyzed the expression patterns of 1274 genes in the developing nervous system focusing in genes expressed in the forebrain and, following a preliminary analysis, we finally selected for further study 4 genes namely ncapg, Elfn1, Elfn2 and HSPC280.ncapg codes for a protein of the condensin I complex. Condensins are two heterodimer complexes (condensin I and condensin II) which play crucial role in the stability, the integrity and the formation of the condensed mitotic chromosomes. The study of the ncapg mRNA distribution revealed that this gene is almost exclusively expressed in the developing forebrain and, in particular, in neurogenic zones. The mRNA of the ncapg was first detected at E11.5 in the ventricular zone of the telencephalon and at low levels in the ventricular zone of the mesencephalon. One day later, the distribution of the mRNA was maintained in the aforementioned regions but also appeared in the ventricular zone of the septum. This pattern of expression was also observed E13.5, Ε14.5 and E15.5, when low levels of expression were also detected in the ventricular zone of the hippocampus, of the habenula and of the preoptic area. At E15.5 low levels of ncapg was also detected in retina. As of E16.5 the expression of ncapg persisted only in the retina and in neuroepithelium of cortex and caudate putamen.In the course of the analysis of the ncapg expression pattern, we developed a novel, faster and more sensitive method for in situ hybridization as this gene is expressed at very low levels. Assuming that improvement in sensitivity could be achieved by improving the fixation step, we tested a recently described zinc based fixative. This modification significally improved the sensitivity of in situ hybridization. Moreover, our method provides excellent preservation of tissue morphology, is rapid and especially suitable to implement in the study of genes expressed at low levels and/or in sparse cells within a structure.We then studied the spatiotemporal pattern of Elfn1 and Elfn2 which code for two proteins of the eLRR family. The members of the eLRR family are transmembrane proteins with a large extracellular domain that consists of several short leucine rich repeats, along with an immunoglobulin or a fibronectin type-3 domain. Several members of this family have been implicated in various aspects of neural development such as differentiation, migration, and neurite outgrowth. The study of the mRNA distribution of Elfn1 and Elfn2 revealed that these genes are expressed in the forebrain and their expression patterns are overlapping but clearly distinguishable.As for the Elfn1, it was first observed at E12.5. At this stage high levels of Elfn1 mRNA were detected in the mantle layer of medial ganglionic eminence and in the lateral part of hypothalamus. One day later, the expression of Elfn1 was maintained in the aforementioned structures but was also observed in the mantle of lateral ganglionic eminence and in the habenula of hypothalamus. At the E14.5 low levels of Elfn1 mRNA were detected in sparse cells of cerebelar cortex and in the hippocampus. At later stages and in the adult the expression of Elfn1 was detected at the cortex, the hippocampus, the septum, the globus pallidus and the habenula.The expression of Elfn2 mRNA was first detected at E13.5. At this stage high levels of Elfn2 mRNAwere observed in cortical plate, in the hippocampus, in the mantle layer of the medial and lateral ganglionic eminence, in the amygdala and in the hypothalamus. At E14.5 apart from the aforementioed regions, the Elfn2 mRNA was detected in the preplate and, from E15.5 onwards, in the septum. As of E18.5 and in the adult, high levels of Elfn2 expression were maintained in the cortical plate, in the septum, in the amygdala, in the hippocampus, in the preoptic area, in the globus pallidus, in the caudate putamen and in the substantia nigra.The last gene that we studied was HSPC280, a gene encoding a highly conserved protein of eukaryotes, member of the winged helix family of proteins. Yet several studies indicate that HSPC280 is not a DNA binding protein. The expression of HSPC280 was first detected at E11.5 in the medial ganglionic eminence. At E12.5 the HSPC280 mRNA was detected in the subventricular zone of the medial and the lateral ganglionic eminence, in the subventricular zone of the cortex and in the thalamus. This pattern was maintained at E13.5. Moreover, the HSPC280 mRNA was also observed in a cell population that was initially localized in the ventral part of cortex and gradually until E15.5 is extended dorsally to the hippocampus. As of E15.5 the expression of HSPC280 reduced gradually. From E16.5 to P0, low levels of expression were detected in the caudate putamen, a derivative of the medial ganglionic eminence, in the subventricular zone of the cortex, in the cortical plate and in the dentate gyrus of hippocampus. Finally, in the adult brain, the HSPC280 mRNA was restricted in the dentate gyrus of hippocampus. The comparative analysis of HSPC280 expression with Lhx6, Dlx2 and cyclinD2 in the ganglionic eminences revealed that within these structures, HSPC280 is expressed exclusively in the subventricular zone in a cell population expressing also cyclinD2, and in the medial ganglionic eminence, Lhx6. Using primary cultures from the ganglionic eminence of E13.5 embryonic brain we showed that all the cells that express cyclinD2, express also HSPC280. Finally, we performed overexpression studies in the Neuro2a cell line and, following differentiation, we showed that the overexpression of HSPC280 results in the reduction of the number of the differentiated cells, suggesting that this protein may act by blocking cell cycle exit.

Τα τελευταία χρόνια καταβάλλονται μεγάλες προσπάθειες, με πληθώρα μεθοδολογικών προσεγγίσεων προκειμένου να γίνουν κατανοητοί οι μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί που ενέχονται στην ανάπτυξη, στη λειτουργία και στη γήρανση του νευρικού συστήματος. Πέρα από το επιστημονικό ενδιαφέρον, η αποκάλυψη των συγκεκριμένων μηχανισμών έχει τεράστια σημασία για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των ασθενειών του νευρικού συστήματος και για τον σχεδιασμό λελογισμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Σκοπός του παρόντος διδακτορικού ήταν ο χαρακτηρισμός νέων γονιδίων τα οποία εκφράζονται στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο του ποντικού καθώς και η μελέτη του προτύπου έκφρασής τους κατά την ανάπτυξη. Προκειμένου να χαρακτηρίσουμε νέα γονίδια τα οποία εκφράζονται στην ανάπτυξη του εγκεφάλου του ποντικού, ακολουθήσαμε τη στρατηγική της ανάλυσης των δεδομένων που υπάρχουν σε δύο βάσεις δεδομένων αδρής έκφρασης και συγκεκριμένα στην Genepaint και στην Allen Brain. Η πρώτη από τις δύο βιβλιοθήκες παρέχει πληροφορίες που αφορούν στο στάδιο Ε14.5 ενώ η δεύτερη δεδομένα που αφορούν εκτός από τον αναπυσσόμενο και στον εγκέφαλο του ενηλίκου ατόμου. Χρησιμοποιήσαμε αναλύσεις συσχέτισης που παρέχονται από τις βάσεις, και ακολούθως εξετάσαμε ανεξάρτητα τα παρεχόμενα αδρά πρότυπα έκφρασης 1274 γονιδίων και στη συνέχεια εστιαστήκαμε στον τελεγκέφαλο, που αποτελεί το πλέον περίπλοκο τμήμα του νευρικού συστήματος και το λιγότερο μελετημένο. Καταλήξαμε να ταυτοποιήσουμε 4 νέα γονίδια, τα ncapg , Elfn1, Elfn2 και HSPC280.Το γονίδιο ncapg κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη του συμπλέγματος της κοντενσίνης Ι. Οι κοντεσίνες είναι δύο μεγάλα πρωτεϊνικά ετεροπενταμερή σύμπλοκα (κοντενσίνη Ι και ΙΙ) τα οποία θεωρείται ότι έχουν κεντρικό ρόλο στη διατήρηση της σταθερότητας, της ακεραιότητας και του σχήματος των συμπαγών μιτωτικών χρωμοσωμάτων. Η μελέτη της κατανομής του mRNA του ncapg έδειξε ότι το συγκεκριμένο γονίδιο εκφράζεται αποκλειστικά στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα και ειδικότερα σε περιοχές του εγκεφάλου στις οποίες υπάρχει έντονη νευρογένεση. Το mRNA του ncapg ανιχνεύθηκε από την Ε11.5 στην κοιλιακή ζώνη του τελεγκεφάλου, και σε χαμηλά επίπεδα, στην κοιλιακή ζώνη του μεσεγκεφάλου. Μία μέρα αργότερα, η κατανομή του mRNA του ncapg παραμένει στις προαναφερθείσες περιοχές ενώ εμφανίστηκε και στην κοιλιακή ζώνη του διαφράγματος. Από την Ε13.5 έως και την Ε15.5 το πρότυπο έκφρασης του ncapg παρέμεινε ίδιο με την Ε12.5, με τη διαφορά ότι παρατηρήθηκε έκφρασή του και στην κοιλιακή ζώνη του ιπποκάμπου, της ηνίας και της προοπτικής περιοχής, ενώ από την Ε15.5 άρχισε να εμφανίζεται σε χαμηλά επίπεδα έκφραση στον αμφιβληστροειδή. Από την Ε16.5 μέχρι και το ενήλικο άτομο η έκφραση του γονιδίου περιορίζεται σταδιακά στον αμφιβληστροειδή και σε πολύ χαμηλά επίπεδα στο νευροεπιθήλιο του φλοιού και του κερκοφόρου κελύφους. Στο πλαίσιο της μελέτης της έκφρασης του ncapg χρειάστηκε να αναπτύξουμε μια νέα ταχύτερη και πιο ευαίσθητη μέθοδο υβριδοποίησης in situ προκειμένου να αναλύσουμε την κατανομή του συγκεκριμένου mRNA το οποίο εκφράζεται σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα. Θεωρώντας ότι η βελτίωση της ευαισθησίας θα μπορούσε να επιτευχθεί βελτιώνοντας τις συνθήκες μονιμοποίησης δοκιμάστηκε ένα μονιμοποιητικό που βασίζεται στον ψευδάργυρο. Η τροποποίηση αυτή βελτίωσε σημαντικά την ευαισθησία της υβριδοποίησης in situ χωρίς ενίσχυση της μη ειδικής χρώσης, μείωσε στο 50% τον χρόνο που απαιτείται για την μέθοδο διατηρώντας παράλληλα άριστη τη μορφολογία των ιστών.Ακολούθησε η μελέτη του χωροχρονικού προτύπου των γονιδίων Εlfn1 και Elfn2 τα οποία κωδικοποιούν δύο πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των eLRR. Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει ένα σύνολο διαμεμβρανικών πρωτεϊνών οι οποίες αποτελούνται από ένα μεγάλο εξωκυττάριο τμήμα στο οποίο συναντώνται επαναλαμβανόμενα μοτίβα πλούσια σε κατάλοιπα λευκίνης (LRR) και μια επικράτεια ανοσοσφαιρίνης ή φιμπρονεκτίνης. Αρκετά μέλη της οικογένειας αυτής έχουν πολύ σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση, στη μετανάστευση των νευρώνων και την ανάπτυξη των νευριτών. Η μελέτη της κατανομής του mRNA των Εlfn1 και Elfn2 έδειξε ότι αυτά τα γονίδια εκφράζονται στον εμπρόσθιο εγκέφαλο και μάλιστα τα πρότυπα έκφρασής τους είναι επικαλυπτόμενα αλλά σαφώς διακριτά. Πιο συγκεκριμένα, το mRNA του Εlfn1 ανιχνεύθηκε από την Ε12.5 στο μανδύα της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής και στο πλευρικό τμήμα του υποθαλάμου. Μια μέρα μετά εκτός από τις παραπάνω περιοχές η έκφρασή του εντοπίστηκε στο μανδύα της πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής και στην ηνία του υποθαλάμου, σε χαμηλά επίπεδα. Από την Ε14.5 ασθενής έκφραση του Εlfn1 ανιχνεύθηκε σε μεμονωμένα κύτταρα του εγκεφαλικού φλοιού, στον ιππόκαμπο και στο διάφραγμα. Η έκφραση στον φλοιό και στον ιππόκαμπο ενισχύθηκε στα όψιμα στάδια της εμβρυογένεσης, ενώ παρέμεινε σταθερή στην ηνία και στις γαγγλιονικές προεξοχές. Στο ενήλικο άτομο η έκφραση του Εlfn1 ανιχνεύθηκε στον φλοιό, στον ιππόκαμπο, στο διάφραγμα, στην ηνία και στην ωχρή σφαίρα, παράγωγο της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής.Η έκφραση του Elfn2 ανιχνεύθηκε αρχικά κατά την Ε13.5. Στο στάδιο αυτό υψηλά επίπεδα του mRNA του ανιχνεύθηκαν στη φλοιϊκή πλάκα, στον ιππόκαμπο, στον μανδύα της μέσης και πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής, στην περιοχή της αμυγδαλής και στον υποθάλαμο. Κατά Ε14.5 εκτός από τις παραπάνω περιοχές το mRNA του Elfn2 ανιχνεύθηκε επίσης στην υποφλοιϊκή πλάκα, και, από την Ε15.5, και στο διάφραγμα. Το πρότυπο αυτό παρέμεινε αναλλοίωτο μέχρι την ολοκλήρωση της εμβρυογένεσης. Τέλος, στο ενήλικο άτομο η έκφραση του Elfn2 ανιχνεύθηκε στη φλοιϊκή πλάκα, στο διάφραγμα, στην αμυγδαλή, στον ιππόκαμπο, στην προοπτική περιοχή, στην ωχρή σφαίρα, στο κερκοφόρο κέλυφος και στην ανώνυμη ουσία.Το επόμενο γονίδιο που μελετήθηκε ήταν το HSPC280 που κωδικοποιεί μια ιδιαίτερα συντηρημένη πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών οργανισμών η οποία ανήκει στις πρωτεΐνες με δομή φτερωτής έλικας, ωστόσο θεωρείται ότι δεν αποτελεί πρωτεΐνη που προσδένεται στο DNA. Η έκφραση του HSPC280 ανιχνεύθηκε αρχικά σε πολύ χαμηλά επίπεδα κατά την Ε11.5 στη μέση γαγγλιονική προεξοχή. Από την Ε12.5 η έκφρασή του mRNA του HSPC280 ανιχνεύθηκε στην υποκοιλιακή ζώνη της μέσης και της πλευρικής γαγγλιονικής προεξοχής, στην υποκοιλιακή ζώνη του φλοιού και στον θάλαμο. Κατά την Ε13.5 το mRNA του HSPC280 ανιχνεύθηκε εκτός από τις γαγγλιονικές περιοχές, στον φλοιό, σε έναν πληθυσμό κυττάρων που αρχικά εντοπίζεται στο κοιλιακό τμήμα του φλοιού και σταδιακά επεκτείνεται ραχιαία μέχρι και στον ιππόκαμπο. Το πρότυπο αυτό παραμένει μέχρι και την Ε15.5 με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου να μειώνονται σταδιακά. Από την Ε16.5 έως και την P0, χαμηλά επίπεδα έκφρασης του HSPC280 εντοπίστηκαν στο κερκοφόρο κέλυφος, στην υποκοιλιακή ζώνη του φλοιού, στη φλοιϊκή πλάκα και στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου. Τέλος, στο ενήλικο άτομο, η έκφραση του γονιδίου ανιχνεύθηκε στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου σε πολύ χαμηλά επίπεδα.Η συγκριτική ανάλυση της έκφρασης του HSPC280 με τρία πολύ καλά μελετημένα γονίδια, τα Lhx6, Dlx2 και cyclinD2, με πειράματα υβριδοποίησης in situ σε στεφανιαίες διαδοχικές τομές των γαγγλιονικών προεξοχών κατά την Ε13.5, έδειξε πως το HSPC280 εκφράζεται αποκλειστικά στην υποκοιλιακή ζώνη, σε έναν πληθυσμό κυττάρων ο οποίος εκφράζει επισης το cyclinD2, και στην περίπτωση της μέσης γαγγλιονικής προεξοχής και το Lhx6. Επιπλέον, με πειράματα ανοσοφθορισμού και ανοσοϊστοχημείας σε κύτταρα πρωτογενούς καλλιέργειας από τις γαγγλιονικές προεξοχές εμβρύων ποντικού Ε13.5, δείχθηκε ότι όλα τα κύτταρα που εκφράζουν cyclinD2 εκφράζουν και την HSPC280. Τέλος, πειράματα υπερέκφρασης της HSPC280 σε ευκαρυωτικά καρκινικά κύτταρα της σειράς Neuro2a, τα οποία στη συνέχεια κατευθύνθηκαν προς διαφοροποίηση, έδειξαν πως η υπερέκφραση της HSPC280 έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των διαφοροποιημένων κυττάρων, γεγονός που οδηγεί στο πιθανό συμπέρασμα πως η εν λόγω πρωτεΐνη μπορεί να εμποδίζει τα κύτταρα να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο.