Η συσχέτιση των πολυμορφισμών G894T και T786C του γονιδίου της ενδοθηλιακής συνθετάσης του νιτρικού οξειδίου με τη λειτουργικότητα των αγγείων και τη φλεγμονή σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη και διαβητικό πόδι

Abstract

Background: Diabetes Mellitus (DM) is associated with endothelial dysfunction, increased arterial stiffness and a chronic systemic low grade inflammation. Diabetic foot (DF) is the most common complication of poorly controlled DM and is associated with increased morbidity. DF is developed among others as a consequence of microvascular and macrovascular impairment. Purpose: The pathogenesis of microvascular disease of DM type 2 (T2D) patients is poorly understood. In this study, we investigated the associations between DF, endothelial dysfunction and arterial elastic properties in T2D patients, as well as the association of genetic variability on endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene with the progression of microvascular disease in T2D patients.Methods: We enrolled 284 consecutive T2D subjects visiting our outpatient diabetes clinic and 196 age- and sex-matched healthy control subjects without evidence of diabetes or cardiovascular or other disease. All the T2D patients underwent assessment by Diabetologist Specialists for DF diagnosis. Endothelial function was assessed by brachial flow mediated dilatation (FMD), while carotid-femoral pulse wave velocity (PWV) and augmentation index (AIx) were determined by SphygmoCor and applanation tonometry as markers of arterial elastic properties. Blood samples were used to measure plasma levels of C-reactive protein (CRP) and interleukin-6 (IL-6), as markers of systemic low grade inflammation, as well as for estimation of Cr Cl MDRD. Moreover, blood samples were drown from 202 of these T2D patients for measurement of vascular endothelial growth factor (VEGF) and for genotyping for single nucleotide polymorphisms (SNP) T786C and G894T on eNOS gene. Finally, patients were re-assessed at 30months for progression of diabetic microangiopathy (defined as development of new diabetic foot, new diabetic retinopathy and/or decline in MDRD eGFR>25%). Results: Prevalence of DF was 24.6% among T2D patients. There were no significantdifferences in age, sex, cardiovascular risk factors (such as smoking, hypertension, and hyperlipidemia), and HbA1c% between T2D with DF and no DF (NDF) (P=NS for all). However, DF patients had significantly increased T2D duration compared to NDF patients (19.5±1.1 vs. 12.0±0.6 years, P=0.001). As expected, T2D was associated with lower FMD and increased PWV and AIx compared with subjects without diabetes, while DF was associated with further adverse effects on endothelial function and arterial stiffness within the group of T2D patients. Staging of DF (according to the University of Texas diabetic wound classification system) was significantly associated with log [FMD] (ρ=-0.165, P=0.006), AIx (ρ=0.200, P<0.05), and log [PWV] (ρ=0.234, P<0.05). Moreover, T2D duration was positively associated with both PWV and AIx but only modestly with FMD. On the other hand, log [HbA1c%] was not associated with FMD, PWV, or AIx (P=NS for all). There were no significant differences in CRP and IL-6 levels between DF and NDF patients (p=NS for both). In multivariate analysis, brachial FMD and AIx remained independent predictors of DF (R2 for the model: 0.167, P=0.005). Regarding the genotyping results, we found out that 786CC homozygotes had significantly higher levels of VEGF compared with 786CT and 786TT subjects (CT/TT: 383.3 ± 43.6 pg/mL vs. CC:586.5±91.8pg/mL, p<0.05). Similarly, 894TT homozygotes had higher VEGF plasma levels compared to other genotypes (624.9 ± 145.2 vs. 390.6 ± 40.0, respectively, p<0.05). By using an additive genetic risk model, carriers of either 894T or 786C were independently associated with increased odds ratio for microvascular disease progression (for 894T: OR=2.753[95%CI: 1.146-6.615], p<0.05) and for 786C: OR=3.137 [95%CI: 1.281-7.686], p<0.05). Presence of both 894T/786C risk alleles, had an additive effect on the risk for microvascular disease progression (OR=4.740 [95%CI: 1.582-14.204, p=0.005), independently of age, sex and BMI. Conclusions: We provide the first evidence that DF in T2D is associated with endothelial dysfunction and increased stiffness of large arteries. We observed that endothelial dysfunction is installed at an early stage in the course of diabetes, while impairment of vascular elasticity is a gradual process in T2D patients. Our results show increasing arterial stiffness with T2D duration (independently of glycemic control), indicating an ongoing vascular stiffening, which is strongly associated with DF. Even though no data were collected on ankle-brachial index or direct blood flow measurements in lower extremities, our findings suggest that both brachial FMD and AIx are strongly and independently associated with DF. Further evidence is needed to clarify whether these widely used vascular function indices could have a role as screening tools for the risk stratification of T2D patients. Finally, we demonstrate that genetic variability on eNOS gene is independently associated with development of new diabetic foot, new diabetic retinopathy or decline in renal function at 30 months in T2D patients. This reported interaction between genetic variability on eNOS gene and progress of diabetic microangiopathy, possibly via effects on angiogenesis mechanisms, warrants further investigation.

Εισαγωγή: Ο Σακχαρώδης Διαβήτης (ΣΔ) σχετίζεται με ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, αυξημένη αρτηριακή σκληρία και χρόνια συστηματική φλεγμονή. Το Διαβητικό Πόδι (ΔΠ) αποτελεί τη συχνότερη επιπλοκή του μη ελεγχόμενου ΣΔ και σχετίζεται με αυξημένη νοσηρότητα. Το ΔΠ, μεταξύ άλλων, αναπτύσσεται ως συνέπεια της μικροαγγειακής και μακροαγγειακής δυσλειτουργίας.Σκοπός: Οι παθογενετικοί μηχανισμοί της διαβητικής μικροαγγειοπάθειας δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Στη μελέτη μας διερευνήσαμε τις πιθανές συσχετίσεις του ΔΠ με την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, την αρτηριακή σκληρία και τη φλεγμονή σε ανθενείς με ΣΔ τύπου 2 (ΣΔ-2), καθώς επίσης και τον πιθανό συσχετισμό της γενετικής μεταβλητότητας του γονιδίου της ενδοθηλιακής συνθετάσης του νιτρικού οξειδίου (eNOS) με την εξέλιξη της μικροαγγειακής νόσου σε ασθενείς με ΣΔ-2. Μέθοδοι: Συμμετείχαν 284 ασθενείς με ΣΔ-2 και 196 υγιείς-μάρτυρες αντίστοιχης ηλικίας και φύλου, μη πάσχοντες από ΣΔ, καρδιαγγειακή ή άλλη νόσο. Όλοι οι ασθενείς με ΣΔ-2 εκτιμήθηκαν από ειδικούς διαβητολόγους προκειμένου να ελεγχθεί η παρουσία ή απουσία νόσου ΔΠ. Η ενδοθηλιακή λειτουργία εκτιμήθηκε μέσω της ενδοθηλιο-εξαρτώμενης διάτασης της βραχιονίου αρτηρίας (brachial flow mediated dilation - FMD), ενώ η καρωτιδο-μηριαία ταχύτητα σφυγμικού κύματος (carotid-femoral pulse wave velocity – PWV) και ο δείκτης ενίσχυσης ανακλώμενων κυμάτων augmentation index - AΙx), καθορίστηκαν μέσω της συσκευής SphygmoCor, ως δείκτες των ελαστικών ιδιοτήτων της αορτής και των μεγάλων αγγείων. Τα επίπεδα στον ορό της hsCRP και της IL-6 μετρήθηκαν ως δείκτες συστηματικής φλεγμονής, ενώ εκτιμήθηκε και η κάθαρση κρεατινίνης (Cr Cl MDRD), ταυτόχρονα με άλλους βιοχημικούς βιοδείκτες, συμπεριλαμβανομένης της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1c). Επιπλέον, σε 202 από τους ανωτέρω ασθενείς μετρήθηκαν τα επίπεδα του αγγειακού αυξητικού ενδοθηλιακού παράγοντα (VEGF), ενώ καθορίστηκε και ο γονότυπός τους για τους πολυμορφισμούς Τ786C και G894T του γονιδίου της eNOS. Τέλος, οι ασθενείς επανεκτιμήθηκαν μετά από 30 μήνες για τυχόν εξέλιξη της διαβητικής μικροαγγειοπάθειας (οριζόμενης ως ανάπυξη νέου ΔΠ, νέας διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας (ΔΑ) και/ή έκπτωση της Cr Cl MDRD >25%). Αποτελέσματα: Η επίπτωση του ΔΠ μεταξύ των ασθενών με ΣΔ-2 ήταν 24,6%. Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην ηλικία, το φύλο, τους καρδιαγγειακούς παράγοντες κινδύνου (όπως τα κάπνισμα, η υπέρταση και η υπερλιπιδαιμία), και την HbA1c, μεταξύ των ασθενών με ΔΠ και χωρίς ΔΠ (ΧΔΠ) (P=NS για όλα). Ωστόσο, οι ασθενείς με ΔΠ είχαν σημαντικά αυξημένη διάρκεια ΣΔ-2 σε σύγκριση με αυτούς ΧΔΠ (19.5±1.1 vs. 12.0±0.6 years, P=0.001). Όπως αναμέναμε, οι ασθενείς με ΣΔ-2 είχαν χαμηλότερο FMD και αυξημένο PWV και AΙx σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, ενώ οι ασθενείς με ΔΠ βρέθηκαν περισσότερο επιβαρυμένοι αναφορικά με την ενδοθηλιακή λειτουργία και την αρτηριακή σκληρία, μεταξύ των ασθενών με ΣΔ-2. Η σταδιοποίηση του ΔΠ (σύμφωνα με το σύστημα ταξινόμησης του διαβητικού τραύματος του Πανεπιστημίου του Texas) σχετίσθηκε στατιστικά σημαντικά με τις τιμές των log [FMD] (ρ=-0.165, P=0.006), AIx (ρ=0.200, P<0.05), και log [PWV] (ρ=0.234, P<0.05). Επιπλέον, η διάρκεια του ΣΔ-2 είχε έντονα θετική συσχέτιση με τους δείκτες PWV και AIx αλλά μόνο μέτρια με το FMD, ενώ η τιμή log [HbA1c%] δεν συσχετίσθηκε με τα FMD, PWV ή AIx (P=NS για όλα). Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των CRP και IL-6 μεταξύ των ασθενών με ΔΠ και ΧΔΠ. Σε πολυπαραγοντική ανάλυση, τα FMD και AIx παρέμειναν ανεξάρτητοι προγνωστικοί δείκτες για το ΔΠ (R2 for the model: 0.167, P=0.005). Όσον αφορά τον καθορισμό των γονοτύπων στους διαβητικούς ασθενείς, βρέθηκε ότι οι 786CC ομοζυγώτες είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα του παράγοντα VEGF σε σχέση με τους 786CT και 786TT γονοτύπους (CT/TT: 383.3 ± 43.6 pg/mL vs. CC:586.5±91.8pg/mL, p<0.05). Παρομοίως, οι 894TT ομοζυγώτες είχαν υψηλότερα επίπεδα του παράγοντα VEGF σε σχέση με τους άλλους γονοτύπους (624.9 ± 145.2 vs. 390.6 ± 40.0, respectively, p<0.05). Με τη χρήση ενός επιπρόσθετου μοντέλου γενετικού κινδύνου, οι φορείς των αλληλόμορφων 894T και 786C σχετίσθηκαν με αυξημένο κίνδυνο εξέλιξης της μικροαγγειοπάθειας [για 894T: OR=2.753 (95%CI:1.146-6.615), p< 0.05 και για 786C: 3.137 (95%CI:1.281-7.686), p< 0.05]. Η ταυτόχρονη παρουσία και των δύο αλληλομόρφων προσδίδει ένα πρόσθετο κίνδυνο για εξέλιξη της μικροαγγειοπάθειας [OR=4.740 (95%CI:1.582-14.204), p=0.005], ανεξάρτητα από την ηλικία, το φύλο και τον δείκτη μάζας σώματος (BMI).Συμπεράσματα: Στη μελέτη μας, το ΔΠ σε ασθενείς με ΣΔ-2 συσχετίσθηκε για πρώτη φορά με την ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και την αυξημένη αρτηριακή σκληρία. Παρατηρήθηκε ότι η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία συμβαίνει στα αρχικά στάδια της νόσου, ενώ η μείωση της ελαστικότητας των αγγείων αποτελεί προοδευτική διαδικασία σε ασθενείς με ΣΔ-2. Τα αποτελέσματα της μελέτης δείχνουν ότι η αρτηριακή σκληρία αυξάνεται ανάλογα με τη διάρκεια του ΣΔ-2 (ανεξάρτητα από το γλυκαιμικό έλεγχο), γεγονός που καταδεικνύει προοδευτικά αυξανόμενη αγγειακή δυσκαμψία, ισχυρά σχετιζόμενη με την εκδήλωση ΔΠ. Επιπλέον, οι δείκτες FMD και AIx αναδείχτηκαν ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί δείκτες της εκδήλωσης ΔΠ σε ασθενείς με ΣΔ-2. Απαιτούνται ωστόσο περαιτέρω έρευνες για να διευκρινιστεί εάν αυτοί οι ευρέως χρησιμοποιούμενοι δείκτες αγγειακής λειτουργίας θα μπορούσαν να έχουν ρόλο ως εργαλεία διαλογής για τη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών με ΣΔ-2. Τέλος, καταδείξαμε ότι η γενετική μεταβλητότητα του γονιδίου της eNOS συσχετίζεται ανεξάρτητα με την ανάπτυξη νέου ΔΠ, νέας ΔΑ ή έκπτωσης της νεφρικής λειτουργίας, σε χρονικό ορίζοντα 30 μηνών, σε ασθενείς με ΣΔ-2. Η εξαχθείσα αυτή αλληλεπίδραση μεταξύ της γενετικής ποικιλομορφίας του eNOS γονιδίου και της εξέλιξης της διαβητικής μικροαγγειοπάθειας, πιθανότατα μέσω επίδρασης αγγειογενετικών μηχανισμών, χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.