Μελέτη του βιολογικού ρόλου της πρωτεϊνικής κινάσης SRPK1 και έλεγχος της λειτουργικότητάς της υπό την επίδραση μικρομοριακών ενώσεων

Abstract

Alternative splicing plays a critical role in cancer as its mechanism is disturbed in cancer cells. Among the kinases that regulate splicing, of major importance is SRPK1 which phosphorylates serine/arginine dipeptides motifs. The expression levels of SRPK1 appear widely disturbed in various tumors, with conflicting roles. Glioblastoma is the most frequent and aggressive malignant cancer of primary brain tumors. SRPK1 is expressed in the mammalian central nervous system in a neuron-specific manner and glial cells are practically devoid of SRPK1. Immunohistochemical analysis revealed that malignant glioma cells express SRPK1, while significant association between SRPK1 expression and patients’ survival was observed. Elevated SRPK1 expression was also detected in the cytoplasm of three glioma cell lines U87, T98 and U251. Small interfering RNA-mediated downregulation of SRPK1, using shRNAs, had little effect on cell viability and resulted in somehow enhanced sensitivity to cisplatin and temozolomide, while no such combinatorial effect was observed with 5-FU, since 5-FU dramatically reduces the protein levels of SRPK1, as opposed to the other two chemotherapeutics. Searching for additional specific inhibitors of SRPK1, 17 newly synthesized compounds, based on the structure of SRPIN340, were tested using in vitro phosphorylation assays but they showed minimal inhibitory activity as compared to SRPIN340. In the context of testing small molecular compounds, lynamicin D, a newly synthesized bisindole pyrrole, exhibited a minor effect on HeLa, A549 and T98G cell viability. However, this compound was able to modulate both constitutive and alternative splicing of reporter mini-genes, mainly by upregulating SRPK1 expression levels. In the last part of this study, we investigated the regulatory mechanisms that modulate the subcellular localization of SRPK1. Indirect immunofluorescence assays revealed that treatment of HeLa cells with various stress-causing agents resulted in the formation of γ-H2AX foci, the concentration of which was proportional to the nuclear accumulation of SRPK1. As the phosphorylated histone H2AX is strictly associated with the presence of double strand breaks (DSBs) on DNA, it is possible that the nuclear translocation of SRPK1, following DNA lesions, is closely associated with the repair mechanism. Next, we confirmed that mutation of two potential phosphorylation sites of SRPK1, threonine 326 and serine 408 to alanine, abolished the nuclear translocation of the kinase, upon treatment of Hela cells with Η2Ο2. Interestingly, the localization of the corresponding phosphomimetic mutants, resulting by substitution of threonine 326 and serine 408 with aspartic acid, was highly cytoplasmic, suggesting that while phosphorylation of the SRPK1 molecule is probably an indispensable post-translational modification for nuclear translocation an additional modification is also required. As such, we tested ubiquitination, based on the UbPred specific predictor of ubiquitination sites. However, mutation of lysine residues 329 and 377, which showed the greatest probability of being ubiquitinated, to arginine did not impair the nuclear translocation of SRPK1 after treatment of HeLa cells with H2O2. Thus, these two lysine residues do not play a critical role in the subcellular localization of SRPK1.

Κυρίαρχη θέση στη ρύθμιση του ματίσματος, κατέχει η SRPK1, η οποία φωσφορυλιώνει σερίνες που αποτελούν μέρος διπεπτιδίων σερίνης/αργινίνης, μοτίβο το οποίο φέρουν και οι SR παράγοντες ματίσματος. Η έκφραση της SRPK1 στους διάφορους όγκους, εμφανίζεται διαταραγμένη χωρίς ο ρόλος της να είναι ταυτόσημος σε όλους τους καρκίνους. Το γλοιοβλάστωμα είναι ο πιο συχνά εμφανιζόμενος και επιθετικός κακοήθης καρκίνος των πρωτογενών εγκεφαλικών όγκων. Η SRPK1 εκφράζεται μόνο στους νευρώνες και όχι στα νευρογλοιακά κύτταρα, σε αντίθεση με τους όγκους γλοιοβλαστώματος, στους οποίους παρατηρήθηκε έκφραση της SRPK1, ενώ τα επίπεδα της συσχετίστηκαν με την επιβίωση των ασθενών. Περαιτέρω διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της SRPK1 στις τρεις γλοιωματικές κυτταρικές σειρές, U87MG, T98G, και U251MG αρχικά επιβεβαίωσε την έκφρασή της όπως και την κυτταροπλασματική εντόπισή της. Η αναστολή της έκφρασης της SRPK1 με shRNA, είχε περιορισμένη επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων ενώ οδήγησε σε μικρή αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στην cis-πλατίνη και την τεμοζολομίδη. Δεν παρατηρήθηκε κανένα συνδυαστικό αποτέλεσμα στην περίπτωση του 5-FU, καθώς το 5-FU μειώνει δραματικά τα επίπεδα έκφρασης της κινάσης, σε αντίθεση με τα άλλα δύο χημειοθεραπευτικά. Στα πλαίσια του ελέγχου της ανασταλτικής δράσης μικρομοριακών ενώσεων απέναντι στην SRPK1, συντέθηκαν 17 νέες ενώσεις με βάση τη δομή του γνωστού αναστολέα SRPIN340 και ελέγχθηκαν σε in vitro πειράματα φωσφορυλίωσης, τα αποτελέσματα των οποίων έδειξαν ότι δεν εμφάνιζαν ανασταλτική δράση συγκρίσιμη με του SRPIN340. Επίσης βρέθηκε ότι το φυσικά προερχόμενο διινδολικό πυρρόλιο, λυναμικίνη D δεν είχε ουσιαστική επίδραση στη βιωσιμότητα των καρκινικών σειρών HeLa, Α549 και T98G. Επηρέαζε όμως τόσο το ιδιοσύστατο όσο και το εναλλακτικό μάτισμα μινι-γονιδίων αναφοράς, κυρίως μέσω της αύξησης των επιπέδων έκφρασης της SRPK1. Διερευνώντας τους τρόπους ρύθμισης της υποκυτταρικής εντόπισης της SRPK1 με δοκιμασίες έμμεσου ανοσοφθορισμού, παρατηρήθηκε μετατόπιση της κινάσης από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα, μετά από επίδραση στρεσογόνων για τα HeLa κύτταρα ουσιών. Μέσω της ανίχνευσης της φωσφορυλιωμένης ιστόνης H2AX, η οποία σχετίζεται με την παρουσία δίκλωνων σπασιμάτων στο DNA, βρέθηκε ότι η μετακίνηση της SRPK1 στον πυρήνα μετά από επίδραση διαφόρων παραγόντων ήταν ανάλογη της φωσφορυλίωσης της H2AX και κατά συνέπεια των δίκλωνων σπασιμάτων που προκαλούσαν οι συγκεκριμένοι παράγοντες στο DNA. Είναι λοιπόν πιθανόν η SRPK1 να εμπλέκεται στο μηχανισμό επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA. Στην αναζήτηση των πιθανών μηχανισμών οι οποίοι διέπουν τη μετακίνηση της SRPK1 στον πυρήνα, επιβεβαιώθηκε ότι η φωσφορυλίωση των δύο πιθανών θέσεων φωσφορυλίωσης της θρεονίνης 326 και της σερίνης 408, αποτελεί μια αναγκαία μετα-μεταφραστική τροποποίηση του μορίου της, καθώς μεταλλάγματα αυτών των θέσεων σε αλανίνη, αδυνατούσαν να εισέλθουν στον πυρήνα υπό την επίδραση Η2Ο2. Τα αντίστοιχα όμως φωσφομιμητικά μεταλλάγματα σε ασπαραγινικό οξύ, υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν εμφάνιζαν πυρηνική εντόπιση, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι απαιτείται κάποια συμπληρωματική τροποποίηση. Ο αλγόριθμος πρόβλεψης θέσεων ουβικιτίνωσης, UbPred έδωσε μεγάλη πιθανότητα ουβικιτίνωσης στις λυσίνες 329 και 377 και κατασκευάστηκαν μεταλλάγματα στα οποία οι συγκεκριμένες λυσίνες αντικαταστάθηκαν με αργινίνη. Τα μεταλλάγματα αυτά δεν απώλεσαν την ικανότητά τους να εισέρχονται στον πυρήνα με H2O2, αναιρώντας την αρχική υπόθεση της ουβικιτίνωσης των θέσεων Lys329 ή Lys377, ως προϋπόθεση για την είσοδο της κινάσης στον πυρήνα.