Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των αλαρμινών HMGB1 και IL33 καθώς και των υποδοχέων τους sRAGEs και sST2 αντίστοιχα, στο πλευριτικό υγρό ασθενών με υπεζωκοτική συλλογή ποικίλης αιτιολογίας

Abstract

Interleukin 33 (IL-33) is a nuclear cytokine from the IL-1 family which is constitutively highly expressed in barrier sites, acting via the suppression of tumorigenicity 2 (ST2) receptor. On the other hand, high-mobility group box 1 protein (HMGB1) is a chromosomal multifunctional redox sensitive protein. Many actions of HMGB1 are mediated through the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE). Both molecules serve various roles in different cellular compartments. Extracellularly, they act as alarmins with multiple roles in immunity and cell homeostasis. Productions of IL-33, HMGB1 and soluble forms of the receptors (sST2 and sRAGE, respectively) have been implicated in several pulmonary diseases. Both axes have been scarcely investigated in pleural diseases. The aims of this thesis were to determine the levels of IL-33 and sST2 as well as ΗΜGB1 and sRAGE in transudative (TrPEs), malignant (MPEs) and parapneumonic (PPEs) pleural effusions (PEs) and investigate the effect of PE fluids with low and high IL-33 or HMGB1 levels on MeT-5A cell adhesion, migration and sphere formation. Further, recombinant IL-33 and HMGB1 were separately used to assess effects on MeT-5A adhesion, migration and sphere formation. IL-33 and sST2 levels were similar among TrPEs, MPEs and PPEs. However, HMGB1 and sRAGE levels were significantly higher and lower, respectively in exudative pleural effusions compared to TrPEs. HMGB1 and sRAGE levels can effectively discriminate transudates from exudates. Remarkably, HMGB1 and sRAGE levels are differentiated between various PEs in an age-dependent manner. A significant positive correlation was found between IL-33 and LDH in TrPEs and between IL-33 and red blood cells (RBCs) in MPEs, while sST2 correlated with lymphocytes in TrPEs. HMGB1 was positively correlated with RBCs and lymphocytes in MPEs. No correlation was found between sRAGE and cellular or specific biochemical characteristics of PEs. Furthermore, we found that in exudates (MPEs and PPEs) high or low levels of IL-33 had significant differential effects on MeT-5A adhesion and migration, while no effect in both cell 33 phenotypes was determined for TrPEs. Further, based on etiology high or low levels of HMGB1 have differential effects on mesothelial cell adhesion, migration and sphere formation. Moreover, significantly decreased MeT-5A cell migration was found when higher concentrations of recombinant IL-33 were used. 50 ng/mL and 100ng/mL of recombinant HMGB1 significantly decreased cell adhesion and sphere size, respectively. These results highlight the emerging role of the IL-33/ST2 and HMGB1/sRAGE axes in pathophysiology of pleural disease. However, further research to improve our understanding of both signaling pathways in pleural homeostasis and disease will be essential to translate aforementioned findings into clinical practice and be able to predict benefits and risks of evolving therapies.

Τόσο η ιντερλευκίνη (IL)-33 όσο και η η πρωτεΐνη υψηλής κινητικότητας της ομάδας Β1 (HMGB1) συνιστούν πολυλειτουργικές πρωτεΐνες που εκφράζονται ιδιοσυστατικά στα κύτταρα των ιστικών φραγμών. Σηματοδοτούν μέσω του υποδοχέα καταστολής της ογκογένεσης 2 (ST2) και του υποδοχέα για τα τελικά προϊόντα προχωρημένης μη ενζυματικής γλυκοζυλίωσης (RAGE), αντίστοιχα. Ο ρόλος των δυο πρωτεϊνών διαφοροποιείται ανάλογα με το κυτταρικό διαμέρισμα στο οποίο εδράζονται. Εξωκυτταρίως, δρουν ως DAMPs (μοριακά πρότυπα σχετιζόμενα με καταστροφή) ή αλαρμίνες, διαδραματίζοντας καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική ομοιόσταση, ιστική επισκευή και αναδιαμόρφωση. Η ενδοκυττάρια σήμανση παρεμποδίζεται από την παγίδευση των IL-33 και HMGB1 από τις διαλυτές εξωκυττάριες ισομορφές sST2 και sRAGE, αντίστοιχα. Τόσο οι αλαρμίνες IL-33 και HMGB1 όσο και οι διαλυτές ισομορφές των υποδοχέων τους, sST2 και sRAGE αντίστοιχα, εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία πολλών νοσημάτων του αναπνευστικού συστήματος. Εντούτοις, ο ρόλος τους στα νοσήματα του υπεζωκότα είναι ελάχιστα μελετημένος. Οι κυριότεροι στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν πρώτον ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των IL-33 και HMGB1 καθώς και των διαλυτών υποδοχέων τους σε διιδρωματικές, κακοήθεις και παραπνευμονικές υπεζωκοτικές συλλογές (ΥΣ). Δεύτερον, η διερεύνηση της in vitro επίδρασης των χαμηλών και υψηλών συγκεντρώσεων των IL-33 και HMGB1 από κάθε τύπο ΥΣ, σε τρεις σημαντικούς κυτταρικούς φαινότυπους που εμπλέκονται στην ιστική αναδιαμόρφωση. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν η κυτταρική προσκόλληση, κυτταρική μετανάστευση και ικανότητα σχηματισμού σφαιροειδών σε κυτταρική σειρά καλοήθων μεσοθηλιακών κυττάρων MeT-5A. Τέλος, αξιολογήθηκε η επίδραση της χρήσης ανασυνδυασμένων IL-33 και HMGB1 στους τρεις ανωτέρω κυτταρικούς φαινότυπους με χρήση κυτταρικής σειράς MeT-5A. Από την παρούσα μελέτη προέκυψε ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στη συγκέντρωση των IL-33 και sST2 μεταξύ των διιδρωματικών, κακοήθων και παραπνευμονικών ΥΣ. Αξιοσημείωτα, τα επίπεδα της HMGB1 και sRAGΕ φάνηκε πως μπορούν να διακρίνουν αποτελεσματικά τα διιδρώματα από τα εξιδρώματα με οριακές τιμές (cut-off values) που χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μια εξαρτώμενη από την ηλικία διαφοροποίηση των επιπέδων HMGB1 και sRAGE στις ΥΣ. Πιθανολογείται ότι η IL-33 συνιστά προϊόν τραυματισμού και δείκτη κυτταρικού στρες των μεσοθηλιακών κυττάρων στις διιδρωματικές ΥΣ, ενώ στις κακοήθεις ΥΣ προϊόν αιμόλυσης. Επίσης, εικάζεται ότι η ΗΜGB1 συνιστά προϊόν των ερυθρών αιμοσφαιρίων και των λεμφοκυττάρων στις κακοήθεις ΥΣ. Όσον αφορά τις in vitro επιδράσεις των χαμηλών και υψηλών συγκεντρώσεων IL-33 και HMGB1 στην κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση και ικανότητα σχηματισμού κυτταρικών σφαιροειδών, τα αποτελέσματα διαφοροποιήθηκαν σημαντικά ανάλογα με το χρόνο της φλεγμονώδους διαδικασίας και τον τύπο της ΥΣ. Τέλος, όσον αφορά τις in vitro επιδράσεις της ανασυνδυασμένης ΙL-33, παρατηρήθηκε ότι η κυτταρική μετανάστευση των καλοήθων μεσοθηλιακών κυττάρων μειώθηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα για τιμές >1 ng/mL). Η χρήση ανασυνδυασμένης HMGB1 σε συγκέντρωση 50 ng/mL μείωσε σημαντικά την κυτταρική προσκόλληση και σε συγκεντρώσεις ίσες ή μεγαλύτερες των 100 ng/mL μειώσε σημαντικά την περίμετρο κυτταρικών σφαιροειδών. Τα ευρημάτα μας υπογραμμίζουν έναν αναδυόμενο ρόλο των σηματοδοτικών αξόνων IL-33/sST2 και HMGB1/sRAGE στην παθοφυσιολογία των μελετούμενων ΥΣ. Φαίνεται πως είτε αυτόνομα είτε και σε συνδυασμό με άλλα σηματοδοτικά μόρια επιδρούν στους επιδιορθωτικούς μηχανισμούς της τραυματισμένης μεσοθηλιακής στιβάδας όπως στην κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση και ικανότητα σχηματισμού σφαιροειδών. Η σε βάθος κατανόηση του ρόλου των αλαρμινών σε μηχανισμούς ιστικής επιδιόρθωσης μπορεί να βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπειών τόσο στην οξεία όσο και στη χρόνια νόσο του υπεζωκότα.