Σχεδιασμός, σύνθεση και βιοχημική αξιολόγηση παραγώγων φυσικών και μη φυσικών αμινοξέων που στοχεύουν αμινοπεπτιδάσεις του ενδοπλασματικού δικτύου

Abstract

In this study is carried out rational design, synthesis and biochemical evaluation of inhibitors of a specific enzyme class of metalloproteases, Endoplasmic Reticulum (ER) aminopeptidases. This category includes the enzymes ERAP1, ERAP2 (Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1, 2) and IRAP (Insulin-regulated Aminopeptidase), which are involved in complex cell signaling pathways, such as the generation of antigenic peptides. By studying the structure of these enzymes through crystallographic data, an attempt was made by our research team to rationalize a series of inhibitors using predictive computational methods. The basis for the design of the inhibitors was 3,4-diaminobenzoic acid (DABA), which is a relatively weak ligand for the catalytic ion Zn (II). Thus, the 1,3-disubstituted 3,4-diaminobenzoic acid' derivatives were obtained. Subsequently, other zinc ion binding groups (ZBGs) based on DABA derivatives were also studied by substituting 3,4-diaminobenzoic acid with other aromatic rings. To these groups, suitable R1 and R2 substituents were added, selected from a set of natural and non-natural amino acid chains predicted to interact with the enzyme’s specificity pockets. These interactions are a prerequisite for the development of an active and selective inhibitor. Finally, a new generation of inhibitors based on the structure of bestatin was studied, aiming at low inhibition values for the endoplasmic reticulum aminopeptidases’. DABA derivatives and their analogs were designed by Dr. Athanasios Papakyriakou, synthesized after extensive research and optimization of synthetic methods and then evaluated in vitro for the three enzymes. Bestatin derivatives were synthesized through two alternative paths and the second path was optimized for higher yields and cleaner products. Finally, an in vitro evaluation of bestatin’s derivatives was performed for the three enzymes.The in vitro enzymatic evaluation of the synthesized compounds revealed several active and selective inhibitors for the three aminopeptidases. Comparison of 1,3- and 1,4-disubstituted diaminobenzoic acid derivatives with the corresponding aminobenzoate, aminonicotinate and hydrazinobenzoate derivatives led to the conclusion that DABA analogs are the most effective inhibitors. Another class of compounds that consist an object of pharmacological interest are the homo-bestatin derivatives by further investigation of P1, P1, Pn sites.Further research efforts on previous studies may lead to better inhibition potency and selectivity for this class of aminopeptidases.

Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός, σύνθεση και βιοχημική αξιολόγηση αναστολέων μιας ειδικής ενζυμικής κατηγορίας μεταλλοπρωτεασών, των αμινοπεπτιδασών του Ενδοπλασματικού Δικτύου (ΕΔ). Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα ένζυμα ERAP1, ERAP2 (Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1, 2) και IRAP (Insulin-regulated Aminopeptidase), τα οποία εμπλέκονται σε πολύπλοκα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης, όπως η δημιουργία αντιγονικών πεπτιδίων. Μελέτες, που έγιναν από την ερευνητική μας ομάδα σε κρυσταλλογραφικά δεδομένα για τη δομή αυτών των ενζύμων, κατέληξαν στο σχεδιασμό μιας σειράς αναστολέων χρησιμοποιώντας υπολογιστικές μεθόδους πρόβλεψης. Τη βάση για το σχεδιασμό των αναστολέων αποτέλεσε το 3,4-διαμινοβενζοϊκό οξύ, που είναι ένας σχετικά ασθενής προσδέτης στο καταλυτικό ιόν Ζn(II). Έτσι προέκυψαν τα 1,3-διϋποκατεστημένα παράγωγα του 3,4-διαμινοβενζοϊκού οξέος. Στη συνέχεια, έγινε μελέτη και σε άλλες ομάδες πρόσδεσης του ιόντος ψευδαργύρου (ZBGs, zinc binding groups) η οποία βασίστηκε στα παράγωγα του διαμινοβενζοϊκού οξέος (DABA), αλλάζοντας το 3,4-διαμινοβενζοϊκό οξύ με άλλους αρωματικούς δακτυλίους. Στις ομάδες αυτές προστέθηκαν κατάλληλοι υποκαταστάτες R1 και R2, οι οποίοι επιλέχθηκαν μέσα από ένα σύνολο αλυσίδων φυσικών και μη φυσικών αμινοξέων, που προβλέπονταν ότι θα αλληλεπιδρούν με τους θύλακες εξειδίκευσης των ενζύμων. Οι αλληλεπιδράσεις αυτές αποτελούν απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη ενός δραστικού και εκλεκτικού αναστολέα. Τέλος, μελετήθηκε μία νέα γενιά αναστολέων βασιζόμενων στη δομή της μπεστατίνης, στοχεύοντας σε χαμηλές τιμές αναστολής για τις αμινοπεπτιδάσες του ενδοπλασματικού δικτύου.Τα παράγωγα DABA και τα ανάλογά τους σχεδιάστηκαν υπολογιστικά από τον διδάκτορα κύριο Αθανάσιο Παπακυριακού, συντέθηκαν μετά από εκτενή διερεύνηση και βελτιστοποίηση των μεθόδων σύνθεσης και στη συνέχεια αξιολογήθηκαν in vitro για τα τρία ένζυμα. Τα παράγωγα της μπεστατίνης συντέθηκαν μέσω δύο εναλλακτικών πορειών και έγινε βελτιστοποίηση της δεύτερης πορείας για υψηλότερες αποδόσεις και καθαρότερα προϊόντα. Επίσης, έγινε in vitro αξιολόγηση των παραγώγων μπεστατίνης για τα τρία ένζυμα.Η in vitro ενζυμική αξιολόγηση των συντιθέμενων ενώσεων φανέρωσαν αρκετούς δραστικούς και εκλεκτικούς αναστολείς για τις τρεις αμινοπεπτιδάσες. Σύγκριση των 1,3- και 1,4- διϋποκατεστημένων παραγώγων του διαμινοβενζοϊκού οξέος με τα αντίστοιχα αμινοβενζοϊκά, αμινονικοτινικά και υδραζινοβενζοϊκά παράγωγα οδήγησε στο συμπέρασμα ότι τα DABA ανάλογα είναι τα πιο αποτελεσματικά για την αναστολή των υπό μελέτη ενζύμων.Μια άλλη κατηγορία ενώσεων που αποτελούν ένα αντικείμενο με φαρμακολογικό ενδιαφέρον είναι τα παράγωγα ομο-μπεστατίνης με περαιτέρω διερεύνηση των θέσεων P1, P1΄, Pn΄.Περαιτέρω ερευνητικές προσπάθειες των προηγούμενων μελετών ίσως οδηγήσουν σε καλύτερη δραστικότητα και εκλεκτικότητα αναστολέων για αυτή την κατηγορία αμινοπεπτιδασών.