Διερεύνηση του ρόλου της γενετικής ποικιλομορφίας των Core/Core+1 πρωτεϊνών του ιού της ηπατίτιδας C στη βιολογική δράση των ιικών πρωτεϊνών και στην παθογένεια της λοίμωξης από τον ιό

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of chronic liver disease that often leads to liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HCV affects approximately 115 million people worldwide. HCV belongs to the genus hepacivirus of the Flaviviridae family. The single-stranded positive-sense RNA genome of HCV (9.6 kb) encodes a polyprotein precursor which is cleaved by cellular and viral proteases to yield 10 structural and non-structural mature proteins. Translation of the polyprotein is mediated by an internal ribosome entry site (IRES) embedded within the 5’ UTR. HCV genome contains a second functional open reading frame (ORF) within the core region, encoding a protein known as ARFP (alternative reading frame protein), F or core+1. Two predominant isoforms of core+1/ARFP have been reported, designated as core+1/S (short) and core+1/L (long), which are produced by Internal translation initiation. The biological role of core+1/ARF protein remains elusive. However, several independent studies have shown the presence of specific anti-core+1/ARFP antibodies in chronically HCV-infected patients, supporting the suggestion that core+1/ARFP is expressed during natural HCV infection. The aim of this PhD thesis is to understand the biological function of core+1/ARF protein in virus associated pathogenesis and also to investigate the molecular mechanisms regulating core+1/ARFP expression. Firstly, we determined, for the first time, the prevalence of anti-core+1 antibodies in HCV patients with cirrhosis. Using an in-house ELISA, we assessed the levels of anti-core+1 antibodies in chronically HCV-infected patients at different stages of cirrhosis in comparison to chronic HCV patients without cirrhosis. 28.7% of HCV patients with cirrhosis were positive for anti-core+1/ARFP antibodies, in contrast with 16.5% of non-cirrhotic HCV patients (p=0.0026). Moreover, there was a significantly higher positivity for anti-core+1 antibodies in HCV patients with advanced cirrhosis (MELD≥15) (36.7 %) compared to those with early cirrhosis (MELD<15) (24 %) (p<0.05). In addition, the levels of alanine transaminase (ALT) were significantly reduced in cirrhotic patients who were positive for anti-core+1 antibodies (p=0.0145). These findings, together with previously published study, supporting the high prevalence of anti-core+1/ARFP antibodies in HCV patients with HCC, suggest that core+1/ARF protein may play a role in virus-associated pathogenesis, and provide evidence to suggest that the levels of anti-core+1 antibodies may serve as a marker for disease progression.In addition, we studied core+1/ARF protein’s expression through two different experimental systems. (a) Firstly, we used HCV JFH1-based bicistronic replicons in order to determine, to a greater extent, the molecular mechanisms regulating core+1/L(Long) expression. JFH1 replicons containing the firefly luciferase (luc) gene, cloned in frame with core+1 sequence, were used. A number of mutations were designed in JFH1 replicons, which were expected to abolish the production of core protein, in order to investigate a possible correlation between the expression of the overlapping core and core+1 ORFs. The mutated JFH1 replicons were introduced into the human hepatoma Huh7-Lunet cells and core+1/ARFP expression was measured. Our results suggest that, possibly, core+1/ARFP expression is mediated by a non-canonical translational mechanism, such as ribosomal shunting. (b) Moreover, a polyclonal antibody against a recombinant core+1/ARF protein of the infectious HCV/JFH1 strain was produced in order to investigate the expression of core+1/ARF protein in cells infected with JFH1 full-length replicons, in the in vitro HCV infectious system. However, the detection of core+1/ARF protein in this system was not possible. Finally, the investigation for the presence of mutations in the core/core+1 region of specific HCV genotype 2 isolates, resulted in the identification of recombinant HCV strains in Greece, for the first time. The detection of the recombinant strains came after the observation that an unusually high rate of HCV type 2 infected patients could not establish sustained virological response after Peg-IFNα/RBV treatment. The sequence of the viral genome of the HCV-type 2 isolates, was analyzed through PCR-sequencing, in order to detect mutations in the core/core+1 region, associated with IFN therapy resistance. Sequence analysis of core-Ε1 region revealed that three patients were infected with HCV strains, phylogenetically related to the intergenotypic 2k/1b recombinant strain, firstly reported in Russia (RF1_ 2k/1b). Further analysis of viral and host genome aimed at the investigation of the IFN-resistance attributes. The identification of recombinant strains is very important for the selection of the appropriate treatment protocol, if IFN/RBV treatment is concerned.

Η μόλυνση με τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) αποτελεί ένα από τα συχνότερα αίτια χρόνιας ηπατικής νόσου, η οποία συχνά οδηγεί σε στεάτωση, κίρρωση και καρκίνο του ήπατος, ενώ περισσότεροι από 115 εκατομμύρια άνθρωποι, είναι φορείς του ιού παγκοσμίως. Ο HCV ανήκει στο γένος Hepacivirus της οικογένειας Flaviviridae. Το γονιδίωμα του ιού συνίσταται σε ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας μεγέθους 9.600 βάσεων, το οποίο κωδικοποιεί μια πολυπρωτεΐνη που διασπάται στη συνέχεια από κυτταρικές και ιικές πρωτεάσες σε 10 ώριμες πρωτεΐνες, δομικές και μη δομικές. Η μετάφραση του ιικού γονιδιώματος ρυθμίζεται από μία περιοχή εσωτερικής πρόσδεσης ριβοσώματος (IRES), εντός της 5΄ μη μεταφραζόμενης περιοχής. Το γονιδίωμα του ιού περιλαμβάνει ένα δεύτερο λειτουργικό ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) εντός της περιοχής της καψιδιακής πρωτεΐνης core, το οποίο κωδικοποιεί μία επιπλέον πρωτεΐνη γνωστή ως ARFP (alternative reading frame protein), F ή core+1. Δύο ισομορφές της core+1 έχουν ανιχνευθεί, μία μικρή (core+1/Short) και μία μεγαλύτερη (core+1/Long) οι οποίες παράγονται πιθανότατα μέσω μηχανισμού εσωτερικής έναρξης της μετάφρασης σε διαφορετικό σημείο. Ο βιολογικός ρόλος της πρωτεΐνης core+1/ARF βρίσκεται υπό διερεύνηση. Πολλές, ανεξάρτητες μελέτες υποστηρίζουν την έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της φυσικής μόλυνσης, μέσω της ανίχνευσης ειδικών αντισωμάτων έναντι της core+1/ARF, σε ορούς ασθενών με οξεία ή χρόνια HCV λοίμωξη. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτελεί η περεταίρω μελέτη της βιολογικής δράσης της core+1 πρωτεΐνης στην παθογένεια της λοίμωξης από τον ιό της ηπατίτιδας C καθώς και η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών έκφρασής της. Αρχικά, προσδιορίστηκε για πρώτη φορά ο επιπολασμός των αντισωμάτων έναντι της core+1/ARF πρωτεΐνης σε HCV ασθενείς με κίρρωση του ήπατος. Με τη χρήση ενός πρωτοκόλλου “home-made” ELISA, προσδιορίστηκε το επίπεδο των αντισωμάτων σε χρόνιους HCV ασθενείς που βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο κίρρωσης, καθώς και σε χρόνιους HCV ασθενείς χωρίς κίρρωση. Αντισώματα έναντι της core+1/ARFP εντοπίστηκαν στο 28.7% και το 16.5% των κιρρωτικών και μη κιρρωτικών ασθενών, αντίστοιχα (p=0.0026). Επιπλέον, ο επιπολασμός των αντι-core+1 αντισωμάτων βρέθηκε σημαντικά αυξημένος στους κιρρωτικούς ασθενείς που βρίσκονται σε προχωρημένο στάδιο κίρρωσης (MELD≥15) (36.7%) σε σχέση με τους κιρρωτικούς ασθενείς αρχικού σταδίου (MELD<15) (24%) (p<0.05). Παρατηρήθηκε επίσης, ότι τα επίπεδα της τρανσαμινάσης ALT ήταν σημαντικά μειωμένα στους κιρρωτικούς ασθενείς οι οποίοι είναι θετικοί σε αντι-core+1 αντισώματα (p=0.0145). Τα ευρήματά μας σε συνδυασμό με προηγούμενα δεδομένα του εργαστηρίου μας, που δείχνουν υψηλή θετικότητα σε αντισώματα έναντι της core+1/ARFP σε HCV ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνο, υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο της πρωτεΐνης στην παθογένεια της λοίμωξης και υποστηρίζουν ότι η παρουσία των αντισωμάτων έναντι της core+1/ARFP μπορεί πιθανόν να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός βιοδείκτης της εξέλιξης της νόσου. Στη συνέχεια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης με χρήση δύο διαφορετικών συστημάτων μελέτης. (α) Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν οι δισιστρονικοί αυτοαντιγραφόμενοι φορείς του ιού της ηπατίτιδας C (JFH1 replicons) προκειμένου να επιτευχθεί η σήμανση του core+1 ORF με luc tag και να διερευνηθεί περαιτέρω ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου ρυθμίζεται η έκφραση της core+1/L(Long) ισομορφής. Οι εν λόγω φορείς, περιέχουν την αλληλουχία που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη core, συζευγμένη με το γονίδιο της λουσιφεράσης Firefly στο +1 ORF. Στους αυτοαντιγραφόμενους φορείς πραγματοποιήθηκε εισαγωγή νουκλεοτιδικών μεταλλαγών, οι οποίες οδηγούν σε λήξη της μετάφρασης σε κωδικόνια της core κωδικής αλληλουχίας προκειμένου να διερευνηθεί η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης των επικαλυπτόμενων core και core+1 ORFs. Η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης μετρήθηκε μετά από τη διαμόλυνση κυττάρων ηπατοκαρκινώματος με τους μεταλλαγμένους φορείς. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι πιθανότατα η έκφραση της core+1/ARF πρωτεΐνης διαμεσολαβείται μέσω ενός εναλλακτικού μηχανισμού μετάφρασης, όπως η «παρέκκλιση του ριβοσώματος» (ribosomal shunting). (β) Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε η παραγωγή ενός πολυκλωνικού αντισώματος έναντι ανασυνδυασμένης core+1/ARF πρωτεΐνης του μολυσματικού στελέχους HCV/JFH1, με σκοπό τη διερεύνηση της έκφρασης της πρωτεΐνης core+1/ARF κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από JFH1 full-length replicons, σε ένα in vitro σύστημα αναπαραγωγής του HCV. Ωστόσο, η ανίχνευση της πρωτεΐνης core+1/ARF στο ανωτέρω σύστημα δεν κατέστη δυνατή. Τέλος, η διερεύνηση της παρουσίας μεταλλαγών/γενετικής ποικιλομορφίας στην core/core+1 περιοχή κλινικών HCV στελεχών γονοτύπου 2 οδήγησε στον εντοπισμό και χαρακτηρισμό, για πρώτη φορά, ανασυνδυασμένων HCV στελεχών στην Ελλάδα. Η ανίχνευση των στελεχών πραγματοποιήθηκε ύστερα από την παρατήρηση ότι ένα ασυνήθιστα μεγάλο ποσοστό ασθενών με HCV, γονοτύπου 2, δεν ανταποκρινόταν στη θεραπεία με Peg-IFNα/Ribavirin. Η αλληλουχία του ιικού γονιδιώματος των HCV στελεχών αναλύθηκε με PCR-sequencing, με σκοπό την ανίχνευση μεταλλαγών στην περιοχή core/core+1, που έχουν συσχετιστεί με ανθεκτικότητα στη θεραπεία. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης της core-Ε1 περιοχής του ιού αποκάλυψαν ότι τρείς από τους ασθενείς ήταν μολυσμένοι με HCV στελέχη τα οποία σχετίζονται φυλογενετικά με το διαγονοτυπικό ανασυνδυασμένο 2k/1b στέλεχος που πρωτοεμφανίστηκε στη Ρωσία (RF1_ 2k/1b). Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με στόχο τη διερεύνηση των χαρακτηριστικών που προσδίδουν την ανθεκτικότητα στην IFN. Η ανίχνευση ανασυνδυασμένων στελεχών έχει μεγάλη σημασία για την επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου στην περίπτωση χορήγησης IFN/RBV.