Ανάπτυξη νέων πολυμερικών βιοϋλικών με ταυτόχρονη χρήση νανοπροσθέτων και φαρμακευτικών ουσιών για ιστομηχανικές εφαρμογές

Abstract

The main objective of the present PhD thesis was the development of new polymer nanocomposites based on poly(lactic acid),containing simultaneously bioactive nanoparticles and and antibacterial agents, as appropriate biomaterials for tissue engineering applications. To achieve this objective, the lack of bioactivity of poly(lactic acid) PLLA, which is a widely used polymer for pharmaceutical and biomedical applications, should be addressed, by the incorporation of bioinert nanoparticles into the polymer matrix, that even in low concentrations, they induce a biological response. For this purpose, silica nanotubes (SiO2 ntbs), nanocrystalline hydroxyapatite, (nHA), strontium-dopped bioglass nanoparticles, (SrnBG) and strontium-substituted hydroxyapatite nanorods, (SrHA nrds), were synthesized using “bottom up” techniques and wet-chemical methods. The nanoparticles which were synthesized with different chemical composition, morphology and size, were fully characterized and they exhibited remarkable physicochemical, structural and pharmacological properties, while their cytotoxicity was estimated in vitro. The addition of the following nanoparticles: SiO2 ntbs, nHA, SrHA nrds and SrnBG, in the polymer matrix of PLLA at a low concentration of 2.5 wt%, using the spin- coating technique, significantly improved its bioactivity, without changing its chemical composition. Afterwards, mirco-pillars (height 8 μm, diameter 4 μm) were constructed on the surface of nanocomposite films based on PLLA, using Thermal- Nanoimprint Lithography (T-NIL), which is a novel «top down» technique for the fabrication of nanomaterials. From this study, it was found that the roughness of a surface, is directly related to the cell-attachment, since, the micro-topography on the surface of the nanocomposite 3D film PLLA/SrnBG 2.5 w%, acted as an ideal ‘’scaffold’’, for the cell attachment and proliferation of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ- MSCs). Afterwards, since microbial growth and biofilm formation is a fundamental challenge underlying various biomaterial-associated applications, the antimicrobial treatment of PLLA was attempted for the first time, exploiting synergistically the benefits of pharmaceutical nanotechnology and T-NIL technique. For this specific purpose, nanoparticles that presented antibacterial activity before and after absorption of chloramphenicol antimicrobial agent (CAM-loaded SrHA nrds και CAM-loaded SiO2 ntbs), were incorporated into PLLA, by spin-coating technique at 1 wt% of the polymer matrix. Interestingly, the antimicrobial treatment which was enhanced by the construction of nature-inspired nano-domains known as «Black Silicon» and «Hierarchical» micro/nano-domains, was found to be highly effective in preventing the attachment of Ε. coli και S. αureus bacteria, on the surface of hybrid-3D PLLA films. Moreover, in order to overcome the issues related to the hydrophobicity and slow degradation rate of PLLA, which limit its in vivo efficacy, D,L-lactide, was co-polymerized with a new monomer (TEHA), which is castor-oil derived di-hydroxy acid. Michael addition and ‘’click’’ chemistry, which were employed for the synthesis of TEHA, proved to be a very promising approach for the synthesis of plant oil derived monomers. Co-polymers with molar ratio TEHA/D,L-lactide 1/140 and with surface micro-topography, constructed by T-NIL technique, turned out to be the most promising and alternative approach to improve the biological response of PLLA.

Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η παρασκευή καινοτόμων πολυμερικών βιοϋλικών με βάση το πολυ(γαλακτικό οξύ) (PLLA) και με ταυτόχρονη χρήση νανοπροσθέτων και φαρμακευτικών ουσιών με αντιβακτηριδιακή δράση, τα οποία θα είναι κατάλληλα για ιστομηχανικές εφαρμογές. Για να επιτευχθεί αυτό, θα πρέπει να αντιμετωπιστεί αποτελεσματικά η απουσία βιοενεργότητας του PLLA, που χρησιμοποιείται εκτεταμένα τα τελευταία χρόνια στην φαρμακευτική τεχνολογία αλλά και στην ιστομηχανική. Για τον παραπάνω σκοπό, παρασκευάστηκαν ανόργανα νανοσωματίδια με υψηλή βιοενεργότητα όπως: νανοσωλήνες διοξειδίου του πυριτίου (SiO2 ntbs), νανοκρυσταλλικός υδροξυαπατίτης (nHA), νανοσωματίδια βιοϋάλου με βάση το στρόντιο (SrnBG) και νανοράβδοι στροντίου-υποκατεστημένου υδροξυαπατίτη (SrHA nrds), με αντιδράσεις σύνθεσης “υγρής χημείας”. Τα νανοσωματίδια που παρασκευάστηκαν χαρακτηρίστηκαν πλήρως και αποδείχθηκε, ότι παρουσιάζουν αξιοσημείωτες φυσικοχημικές, μορφολογικές και φαρμακολογικές ιδιότητες.Τα υλικά αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή νανοσύνθετων πολυμερών μέσω της τεχνικής της περιστροφικής συν-απόθεσης (spin coating) και σε περιεκτικότητα 2.5 wt%. Από τη μελέτη των νανοσύνθετων υλικών σε κύτταρα βρέθηκε ότι η προσθήκη των νανοσωματίδιων SiO2 ntbs, nHA, SrHA nrds και SrnBG στην πολυμερική μήτρα του PLLA βελτίωσε σημαντικά τη βιοσυμβατότητά του, χωρίς όμως να επηρεάζει τη βασική χημική του σύσταση. Έπειτα, στην επιφάνεια παρασκευασμένων υμενίων αποτυπώθηκαν μικρο-κολώνες (micro-pillars) ύψους 8 μm και διαμέτρου 4 μm χρησιμοποιώντας μια καινοτόμα «top down» τεχνική για την παρασκευή νανοϋλικών, τη λιθογραφία νανο-αποτύπωσης εν θερμώ (thermal-nanoimprint lithography ή T-NIL). Από τα νανοσύνθετα 3D υλικά που μελετήθηκαν, βρέθηκε ότι το PLLA/SrnBG 2.5 w% λειτούργησε σαν το ιδανικότερο “ικρίωμα“ πάνω στο οποίο προσκολληθήκαν και πολλαπλασιάστηκαν μεσεγχυματικά βλατοκύτταρα από τη γέλη του Wharton (WJ-MSCs). Στη συνέχεια, επειδή η επιφανειακή μικροβιακή ανάπτυξη και η δημιουργία βιο-φιλμ είναι ένας κίνδυνος που υποβόσκει σε αρκετές εφαρμογές βιοϋλικών, επιχειρήθηκε για πρώτη φορά, η αντιμικροβιακή τροποποίηση του PLLA, αξιοποιώντας συνεργατικά τα οφέλη της φαρμακευτικής νανοτεχνολογίας και της θερμικής NIL. Για το σκοπό αυτό, τα ανόργανα νανοσωματίδια που παρουσίασαν αντιβακτηριακή δράση χρησιμοποιήθηκαν για την προσρόφηση του αντιμικροβιακού παράγοντα χλωραμφενικόλη (CAM), όπως CAM-loaded SrHA nrds και CAM-loaded SiO2 ntbs και εισήχθησαν στην πολυμερική μήτρα του PLLA με συγκέντρωση 1 wt%, χρησιμοποιώντας την τεχνική του spin coating. Η αντιμικροβιακή τροποποίηση των νανοσύνθετων υμενίων ενισχύθηκε επιπρόσθετα με την επιφανειακή δημιουργία εμπνευσμένων από τη φύση νανο-δομών, τύπου «Black Silicon» και ιεραρχιμένων μικρο/νανο-δομών «Hierarchical» οι οποίες παρασκευάστηκαν με τη θερμική NIL. Ο συνδυασμός των ανόργανων νανοσωματιδίων φορτωμένων με CAM και οι μικτές 3D μικρο/νανο-δομές, παρεμπόδισαν αποτελεσματικότερα την προσκόλληση των βακτηρίων Ε. coli και S. αureus στην επιφάνεια των PLLA νανοσύνθετων υμενίων. Τέλος, προκειμένου να αντιμετωπιστούν ζητήματα που περιορίζουν την αποτελεσματικότητα του PLLA in vivo, όπως η υδροφοβικότητά του και ο αργός ρυθμός υδρόλυσης, το D,L-λακτίδιο συμπολυμερίστηκε με ένα νέο μονομερές, το δι-υδροξυοξύ (ΤΕΗΑ), που παράχθηκε με προσθήκη τύπου Michael της 2-μερκαπτοαιθανόλης στο ενδεκανοϊκό οξύ (καστορέλαιο). Η προσθήκη τύπου Michael ως αντίδραση της “κλικ” χημείας, φάνηκε ότι είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για τη σύνθεση μονομερών από φυτικά έλαια. Από τη μελέτη της επιφανειακής μικρο-τοπογραφίας σε υμένια αυτών τα οποία παρασκευάστηκαν με την τεχνική της θερμικής NIL, αποδείχθηκε πως τα συμπολυμερή TEHA-co-PDLLA με μοριακή αναλογία 1/140 αποτελούν έναν εναλλακτικό και αποτελεσματικότερο φορέα για τη βελτίωση της βιολογικής απόκρισης του PLLA.