Τεχνολογική βελτιστοποίηση βιοδραστικών ναφθοκινονών

Abstract

Alkannin (A), shikonin (S) and their derivatives are bioactive natural products with multiple and significant biological activities. Studied under the frame of this thesis was Chemistry, Biology and the development of new Technological applications for these compounds. Thus, a comparative study of five extraction techniques (Soxhlet, ultrasonic, subcritical, supercritical fluid and microwave assisted extraction) of roots of plant Alkanna tinctoria, using two root samples and different extraction conditions, were performed for the first time, evaluating the yield of preliminary extract and the total yield of active fraction (monomers A/S and dimeric ones). The results demonstrated varying advantages/disadvantages among techniques and mainly lead to the conclusion that the choice of an appropriate extraction technique depends mostly on the final application of the preliminary extract. Additionally, A/S and their derivatives were evaluated for their antioxidant activity using two in vitro experimental protocols, the Crocin Bleaching Assay (CBA) and the binding assay of DPPH●, modified appropriately for the evaluation of color compounds. The obtained results contributed to the assessment of the structural characteristics of the molecules that contribute to the free radical scavenging activity (structure-activity relationship, SAR). Naphthazarin showed the strongest action, following by A/S with similar activity between them. The absence of the side -OH, led to a significant reduction of the activity (deoxy-shikonin). Finally, the esterification of the side -OH seemed to depend heavily on various phenomena such as steric effects and polarity. Furthermore, aim of this thesis was the technological utilization and the optimization of existing technologies for these compounds. Thus, for the first time Molecularly Imprinted Polymers (MIPs) for shikonin (template) were prepared and characterized, using both acidic and basic monomers. The results showed the successful imprinting of shikonin and the MIPs’ function as selective adsorbents for purification and isolation of shikonin, from commercial samples, extracts and complex mixtures. Under polar conditions, better behavior was observed for the MIP with the acidic functional monomer (MAA; MIP1). On the contrary, under non-polar conditions the efficient behavior was observed for the MIP with the basic monomer (DEAEMA; MIP2), with over 72% recoveries under SPE. Finally, shikonin-loaded conventional and pegylated liposomes were prepared and evaluated, using DOPC lipid and lipid mixtures with DSPG (negatively charged lipid). The results showed that shikonin encapsulated successfully in both conventional and pegylated liposomes, showing high drug entrapment efficiencies, small mean particle size, satisfactory ζ-potential values and release profile. Finally, a stability study was performed for 28 days at 4oC, proving a satisfactory stability for all liposomes of almost all parameters. The addition of charged DSPG lipid, in almost all cases, improve the physico-chemical and pharmaceutical characteristics of liposomes, however it was observed that it depends on the type of the lipid to which it is added.

Η αλκαννίνη (Α), η σικονίνη (Σ) και τα παράγωγά τους αποτελούν φαρμακευτικές ουσίες με πολλαπλές και σημαντικές βιολογικές δράσεις. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκαν τρεις πυλώνες των ουσιών αυτών, η Χημεία, η Βιολογία καθώς και η ανάπτυξη νέων Τεχνολογικών εφαρμογών αυτών. Έτσι, πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά συγκριτική μελέτη πέντε τεχνικών εκχύλισης (εκχύλιση με διάταξη Soxhlet, υπερήχους, υποκρίσιμη, υπερκρίσιμη και εκχύλιση με μικροκύματα) ριζών του φυτού Alkanna tinctoria, χρησιμοποιώντας δύο δείγματα ριζών και διαφορετικές συνθήκες εκχύλισης, αξιολογώντας την απόδοση του προκαταρκτικού εκχυλίσματος και τις συνολικές ποσότητες σε δραστικές ύλες (μονομερείς και διμερείς Α/Σ). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν απέδειξαν διαφορετικά πλεονεκτήματα/μειονεκτήματα για την κάθε μέθοδο, οδηγώντας στο συμπέρασμα ότι η επιλογή της κατάλληλης τεχνικής εκχύλισης εξαρτάται κυρίως από την τελική εφαρμογή του προκαταρκτικού εκχυλίσματος. Στη συνέχεια οι Α/Σ και τα παράγωγά τους αξιολογήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση, με χρήση δύο in vitro πειραματικών πρωτόκολλων, τη Δοκιμή Αποχρωματισμού της Κροκίνης (CBA) και τη δοκιμή δέσμευσης της DPPH● κατάλληλα τροποποιημένη για την αξιολόγηση έγχρωμων ενώσεων. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, συνέβαλλαν στην αξιολόγηση των δομικών χαρακτηριστικών των μορίων που συνεισφέρουν στην ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών (σχέση δομής-δραστικότητας, SAR). Ισχυρότερη δράση εμφάνισε η ναφθαζαρίνη, ακολούθησαν οι Α/Σ με παρόμοια μεταξύ τους δραστικότητα. Η απουσία του –ΟΗ στην πλευρική αλυσίδα οδήγησε σε σημαντική μείωση της δραστικότητας (δεοξυ-σικονίνη). Τέλος, η εστεροποίηση του πλευρικού –ΟΗ φάνηκε να εξαρτάται από διάφορους παράγοντες, όπως φαινόμενα στερεοχημικής παρεμπόδισης και πολικότητας. Επιπρόσθετα, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η τεχνολογική αξιοποίηση και η βελτιστοποίηση ήδη υπαρχουσών τεχνολογιών για τις ενώσεις αυτές. Έτσι, παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν Μοριακά Αποτυπωμένα Πολυμερή (MIPs) σικονίνης, με χρήση βασικού και όξινου μονομερούς. Τα αποτελέσματα έδειξαν την επιτυχή αποτύπωση της ουσίας αυτής και τη λειτουργία των MIPs ως εκλεκτικά προσροφητικά για τον καθαρισμό και την απομόνωση της σικονίνης από εμπορικά δείγματα, εκχυλίσματα και πολύπλοκα μίγματα. Επίσης παρατηρήθηκε καλύτερη συμπεριφορά του MIP με όξινο λειτουργικό μονομερές (MAA; MIP1) σε πολικές συνθήκες και αποδοτικότερη συμπεριφορά του MIP με βασικό λειτουργικό μονομερές (DEAEMA; MIP2) σε μη-πολικές συνθήκες με ανακτήσεις κατά την εφαρμογή της SPE έως και πάνω από 72%. Τέλος, παρασκευάστηκαν και χαρακτηρίστηκαν συμβατικά και σταθεροποιημένα λιποσώματα σικονίνης με χρήση του λιπιδίου DOPC καθώς και μίγματα λιπιδίων με το αρνητικά φορτισμένο λιπίδιο DSPG. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σικονίνη εγκλείστηκε με επιτυχία τόσο στα συμβατικά όσο και στα σταθεροποιημένα λιποσωμιακά συστήματα, εμφανίζοντας αρκετά υψηλά ποσοστά εγκλεισμού αυτής, μικρά μέσα μεγέθη σωματιδίων, καθώς και ικανοποιητικές τιμές ζ-δυναμικού και προφίλ αποδέσμευσης. Τέλος πραγματοποιήθηκε μελέτη σταθερότητας αυτών για 28 μέρες στους 4οC, αποδεικνύοντας ικανοποιητική σταθερότητα των λιποσωμάτων στα πλαίσια όλων των παραμέτρων. Η προσθήκη του φορτισμένου λιπιδίου DSPG, στις περισσότερες περιπτώσεις, βελτίωσε τα φυσικοχημικά και φαρμακευτικά χαρακτηριστικά των λιποσωμάτων, παρατηρήθηκε όμως ότι εξαρτάται από τον τύπο του λιπιδίου στο οποίο προστίθεται.