Ο ρόλος του χολινεργικού συστήματος στους μηχανισμούς πλαστικότητας και γήρανση του εγκεφάλου

Abstract

Aging leads to changes in neuronal structure and cognitive function. It has been documented that the spectrum of these changes extends from minor structural changes with minor cognitive deficits to significant neurodegeneration accompanied by serious cognitive problems. The cholinergic system shows minor degeneration during normal aging but it is also involved in mechanisms of pathological aging such as Alzheimer’s disease. The goal of the present thesis was the study of the effects of the absence of the β2 subunit of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) on neuronal structure and cognitive function during aging. For this purpose, adult and old wild type and β2-/- mice were used, namely mice with deletion of β2 subunit of nAChRs.In the literature, β2-/- mice have been proposed as a model of accelerated cognitive aging as well as a model of attention deficit hyperactivity disorder. We investigated the validity of these two models following three directions: analysis of neuronal structure of pyramidal cells, study of the performance of the mice in behavioural tasks and measurement of additional aging markers.Firstly, we studied the morphology of YFP+ layer V pyramidal neurons in anterior cingulate cortex and in primary visual cortex. The two brain areas are cytoarchitectonically different but are innervated by neurons originating in the band of Broca. Therefore, the investigation of possible differences between the two areas in the effects of the absence of the β2 subunit of nAChRs during aging could provide valuable information regarding the degree of neuronal vulnerability of different brain areas innervated by the cholinergic system. We found morphological differences between YFP+ cells of the anterior cingulate and primary visual cortex of adult and aged mice, of both genotypes. Furthemore, β2-/- mice showed significant structural deficits already in adulthood in the cingulate and not the visual cortex compared to wild type mice. These deficits either became more pronounced or remained stable during aging. Thus, the anterior cingulate cortex seems more vulnerable to the chronic absence of β2 subunits of nAChRs compared to the visual cortex. This result cannot be attributed to vascular deficits based on measurements in vascular markers.In addition, we studied the effects of aging and genotype on the performance of adult and old wild type and β2-/- mice in behavioural tasks. We found that both adult and old β2-/- mice could not habituate in the open-field task possibly due to decreased exploration compared with wild type mice, as revealed by slow-fast movement analysis. The results of the open field test could not be attributed to different levels of anxiety, since no such differences were observed in the elevated plus maze. Moreover, we found that the β2 subunit is involved in species typical behavior which is analogous to daily activities in humans (Activities of daily living, ADL). More specifically, β2-/- mice showed deficits in burrowing with aging and in nest building already in adulthood. Interestingly these deficits were reversed when β2-/- mice grew-up in enriched environment. No such reversal was observed in the performance of β2-/- mice in hoarding, in which old mice of both genotypes hoarded less food.Analysis of behavior in a series of spatial and non-spatial learning tasks revealed that the absence of β2 subunits of the nAChRs affects higher cognitive functions, particularly in aging. Old β2-/- mice could not discriminate the new object from the familiar one, in the novel object recognition task; however, this deficit was reversed by enriched environment. Moreover, old β2-/- mice could not change strategy for a new target in a spatial learning task (Morris water maze reversal learning). In the memory test of this task, β2-/- show cognitive deficits not only upon aging but also already in adulthood. It should be noted that the cognitive deficits are not accompanied by an increase in serum uric acid as would be expected in old β2-/- mice based on the findings in demented humans.Overall, our experiments demonstrate that β2-/- mice showing selective neuronal and cognitive deficits already in adulthood and during aging could be used as a model of accelerated cognitive aging and not as a model of attention deficit hyperactivity disorder.

Η γήρανση οδηγεί σε αλλαγές στη νευρωνική δομή και κατ’ επέκταση στη γνωστική λειτουργία. Έχει παρατηρηθεί ότι το φάσμα αυτών των αλλαγών εκτείνεται από μικρές δομικές αλλαγές συνοδευόμενες από μικρή γνωστική έκπτωση έως σημαντική νευροεκφύλιση που συνοδεύεται από σοβαρά γνωστικά ελλείμματα. Το χολινεργικό σύστημα θεωρείται ότι παρουσιάζει μικρού βαθμού εκφύλιση κατά τη φυσιολογική γήρανση αλλά έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται σε μηχανισμούς παθολογικής γήρανσης όπως στη νόσο Alzheimer. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των επιπτώσεων της απουσίας της β2 υπομονάδας του νικοτινικού υποδόχεα ακετυλοχολίνης (nAChR) στη νευρωνική δομή και γνωστική λειτουργία σε σχέση με τη γήρανση. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν ενήλικοι και γηρασμένοι φυσιολογικοί και β2-/- μύες, δηλαδή μύες στους οποίους δεν εκφράζονται οι β2 υπομονάδες των nAChRs.Οι β2-/- μύες έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία ως μοντέλο επιταχυνόμενης γνωστικής γήρανσης αλλά και ως μοντέλο της διαταραχής ελλειμματικής προσοχής/υπερκινητικότητας. Για τη διερεύνηση της ισχύος των δύο αυτών μοντέλων ακολουθήθηκαν τρεις ερευνητικοί άξονες: ανάλυση νευρωνικής δομής πυραμιδικών νευρώνων, μελέτη επίδοσης των μυών σε δοκιμασίες συμπεριφοράς και μέτρηση επιπλέον δεικτών γήρανσης.Αρχικά μελετήθηκε η μορφολογία YFP+ πυραμιδικών νευρώνων της στιβάδας V του πρόσθιου φλοιού του προσαγωγίου και του πρωτοταγούς οπτικού φλοιού. Οι δύο αυτές εγκεφαλικές περιοχές είναι κυτταροαρχιτεκτονικά διαφορετικές αλλά έχουν κοινή πηγή χολινεργικής εννεύρωσης από τη διαγώνια ταινία του Broca. Επομένως, η ενδεχόμενη ύπαρξη διαφορών μεταξύ των δύο περιοχών ως προς τις συνέπειες της απουσίας των β2 υπομονάδων των nAChRs κατά τη γήρανση, θα παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με διαφορές στην ευαλωτότητα των διαφορετικών εγκεφαλικών περιοχών του χολινεργικού συστήματος. Βρέθηκε ότι και στους δύο γονότυπους υπήρχαν σημαντικές μορφολογικές διαφορές στα YFP+ κύτταρα της στιβάδας V μεταξύ του φλοιού του προσαγωγίου και του οπτικού φλοιού, τόσο σε ενήλικα όσο και σε γηρασμένα ζώα. Επίσης, οι β2-/- μύες παρουσίασαν σημαντικά δομικά ελλείμματα ήδη από την ενήλικη ζωή στον πρόσθιο φλοιό του προσαγωγίου, αλλά όχι στον πρωτοταγή οπτικό φλοιό, σε σχέση με τους φυσιολογικούς μύες. Τα ελλείμματα αυτά είτε επιδεινώνονταν περαιτέρω είτε παρέμεναν στα ίδια επίπεδα με τη γήρανση. Συνεπώς, φαίνεται ότι ο πρόσθιος φλοιός του προσαγωγίου είναι περισσότερο ευπαθής στη χρόνια απουσία των β2 υπομονάδων των nAChRs σε σύγκριση με τον πρωτοταγή οπτικό φλοιό. Το εύρημα αυτό, όπως φάνηκε από μετρήσεις αγγειακών δεικτών, δεν μπορεί να αποδοθεί σε εκφύλιση των αγγείων.Στη συνέχεια μελετήθηκαν οι επιπτώσεις της γήρανσης και του γονότυπου στην επίδοση των ενήλικων και γηρασμένων φυσιολογικών και β2-/- μυών σε δοκιμασίες συμπεριφοράς. Βρέθηκε ότι οι β2-/- μύες ενήλικοι και γηρασμένοι δεν εξοικειώνονταν στη δοκιμασία στο ανοιχτό πεδίο το οποίο πιθανότατα οφειλόταν σε μειωμένη εξερεύνηση του νέου περιβάλλοντος σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς όπως φάνηκε από την ανάλυση των αργών και γρήγορων κινήσεων. Τα αποτελέσματα στη δοκιμασία του ανοιχτού πεδίου δεν μπορούν να αποδοθούν σε διαφορετικά επίπεδα άγχους, καθόσον δεν παρατηρήθηκαν τέτοιες διαφορές στον υπερυψωμένο λαβύρινθο σε σχήμα σταυρού. Επιπρόσθετα, από τα πειράματά μας προκύπτει ότι η β2 υπομονάδα παίζει ρόλο σε τυπικές για το είδος συμπεριφορές όπως φάνηκε σε ηθολογικές δοκιμασίες οι οποίες αντιστοιχούν με καθημερινές δραστηριότητες σε ανθρώπους (Activities of daily living, ADL). Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι οι β2-/- μύες παρουσίασαν ελλείμματα στη δοκιμασία ορύγματος με τη γήρανση και στην κατασκευή φωλιάς ήδη από την ενήλικη ζωή, τα οποία όμως αντιστράφηκαν όταν οι β2-/- μύες μεγάλωσαν σε εμπλουτισμένο περιβάλλον. Στη δοκιμασία αποθησαύρισης, οι γηρασμένοι μύες και των δύο γονότυπων αποθησαύρισαν λιγότερη τροφή, και η διαβίωση σε εμπλουτισμένο περιβάλλον δεν στάθηκε ικανή να αντιστρέψει αυτό το συμπεριφορικό έλλειμμα. Aπό την ανάλυση της συμπεριφοράς των πειραματόζωων σε μία σειρά από δοκιμασίες που ελέγχουν τις ικανότητες χωρικής και μη-χωρικής μάθησης και μνήμης προκύπτει ότι η απουσία των β2 υπομονάδων των nAChRs επηρεάζει ανώτερες γνωστικές λειτουργίες ιδιαίτερα κατά τη γήρανση. Οι γηρασμένοι β2-/- μύες δεν μπορούσαν να διακρίνουν το νέο αντικείμενο από το οικείο στη δοκιμασία αναγνώρισης αντικειμένου αλλά αυτό το έλλειμμα αντιστράφηκε μετά από διαβίωση σε εμπλουτισμένο περιβάλλον. Επίσης οι γηρασμένοι β2-/- μύες δεν κατάφεραν να αλλάξουν στρατηγική επίτευξης νέου στόχου σε δοκιμασία χωρικής μάθησης (Αντιστροφή Μάθησης στον Υδάτινο Λαβύρινθο κατά Morris). Κατά τον έλεγχο της μνήμης σε αυτή τη δοκιμασία βρέθηκε οι β2-/- μύες παρουσιάζουν γνωστικά ελλείμματα όχι μόνο κατά τη γήρανση αλλά ήδη από την ενήλικη ζωή. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα παρατηρούμενα ελλείμματα δεν συνοδεύονται από αύξηση του ουρικού οξέος στον ορό του αίματος των γηρασμένων β2-/- σε σχέση με τους φυσιολογικούς όπως συναντάται σε ηλικιωμένους ανοϊκούς ανθρώπους. Συνοψίζοντας, από τα πειράματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι οι β2-/- μύες με επιλεκτικά νευρωνικά και γνωστικά ελλείμματα ήδη από την ενήλικη ζωή και κατά τη γήρανση μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοντέλο επιταχυνόμενης γνωστικής γήρανσης και όχι ως μοντέλο της διαταραχής ελλειμματικής προσοχής/υπερκινητικότητας.