The role of Erf in mouse development

Abstract

Erf is a ubiquitously expressed transcriptional repressor regulated by MAPK via nucleo-cytoplasmic shuttling. In its non-phosphorylated form, Erf is nuclear and active as a repressor, while phosphorylation by Erks in the nucleus, leads to cytoplasmic export and inactivation. In its active nuclear form, Erf blocks cell proliferation and arrests cells at G0/G1 phase in a cell type-specific manner. Moreover, Erk signaling is essential to “transform” the cell cycle inhibitory and proapoptotic action of TGF on epithelial cells, into a growth promoting and migratory response, rendering it as repressor of epithelial mesenchymal transition. Erf is also able to suppress ets- and ras-induced tumorigenicity in fibroblasts and Ewing’s Sarcoma cells. However, little is known for the role of Erf in development. Total elimination of Erf in mice leads to lethality at embryonic day E10.5 due to placental defects. Erf knockout embryos fail to undergo chorioallantoic fusion and labyrinth development. To bypass placenta defects and study the role of Erf in the embryo proper, we employed epiblast conditional mice. Here, we show that Erf is required in all three waves of embryo hematopoiesis. The first hematopoietic cells are formed in blood islands in the mouse embryo and have arisen from extraembryonic mesoderm at the neural plate stage of development at embryonic day 7.5 (E7.5) and are called the primitive wave. These primitive erythroblasts that come from the yolk sac comprise the predominant cells in the early circulating blood, resulting to erythroid, macrophage and megakaryocyte cell lineage in bloodstream. Shortly after, at embryonic day E8.25, a second wave is produced in the yolk sac, called the definitive wave and is consisted of erythroid and myeloid progenitors (EMPs). It migrates in bloodstream and finally colonize the fetal liver at embryonic day E10.5. A third wave of hematopoiesis that emerges from the aorta – gonad – mesonephros (AGM) region at E10.5, also migrates in the beginning to the fetal liver and finally the bone marrow, where it comprises the adult hematopoietic stem cells (HSC). Even though HSCs can be found in yolk sac, the AGM seems to be the major source of the adult HSCs. Mice lacking Erf in embryo proper exhibited severe anemia and died around embryonic day (E) 14.5. Erf-/- embryos had reduced peripheral blood cells from E9.5 onwards that precipitated at E14.5. Elimination of Erf resulted in both reduced and more immature blood cells at E9.5-10.5 based on hematoxylin and eosin assays in yolks sacs, counts of circulating blood cells and real-time for transcription levels of globins in circulating blood. These data indicate a defect in the primitive hematopoietic wave. In addition, reduced erythroid-myeloid progenitors and colony forming cells could be detected at peripheral blood at E10.5 based on flow cytometry and colony assays, indicating a defect in the yolk sac derived definitive hematopoietic progenitors. Liver hematopoiesis was also impaired with decreased numbers of precursor and mature cells and inefficient differentiation of immature erythroid precursors. Assays with specific markers for flow cytometry and colony assays confirmed the inefficient differentiation of erythroblasts. Finally, elimination of Erf appeared to be necessary for hematopoietic stem cell maintenance or differentiation, as evident by their impaired repopulation ability. Moreover, we show that reduced levels of Erf cause craniosynostosis in human and mice. Erf mutations were found in humans with craniosynostosis and their significance was studied with cloning of Erf mutations and luciferase assays. Moreover, Runx2, a possible target of Erf in osteogenesis found by Chip-seq, was studied by co-transfection of Erf and Runx2 followed by luciferase assay. It would thus appear that Erf affects the efficiency of the entire hematopoiesis and osteogenesis. To that extend, Erf could serve as an appealing intervention target.

Ο Erf είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας που εκφράζεται σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και ρυθμίζεται από το ΜΑΡΚ μονοπάτι μέσω πυρηνο-κυτταροπλασματικής μετακίνησης. Στη μη φωσφορυλιωμένη μορφή του, ο Erf βρίσκεται στον πυρήνα και είναι ενεργός ως καταστολέας, ενώ η φωσφορυλίωση του από την Erk οδηγεί σε έξοδο στο κυτταρόπλασμα και απενεργοποίηση του. Στην ενεργή πυρηνική του μορφή, ο Erf καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μπλοκάρει τα κύτταρα στη φάση G0 / G1. Επιπλέον, ο Εrf είναι ικανός να παρεμβαίνει στο ΤGF-β επαγώμενο ΕΜΤ μέσω καταστολής της σεμαφορίνης 7α . O Erf είναι επίσης ικανός να καταστέλλει την επαγόμενη από ets και ras ογκογονικότητα σε ινοβλάστες και κύτταρα σαρκώματος Ewing. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του Erf στην ανάπτυξη. Η πλήρης απάλειψη του Erf σε ποντίκια οδηγεί σε θνησιμότητα την εμβρυϊκή ημέρα Ε10.5 λόγω ελαττωμάτων του πλακούντα και τα Εrf knockout έμβρυα αποτυγχάνουν να αναπτύξουν χοροαλλαντοϊκή σύντηξη. Για να παρακάμψουμε τα ελαττώματα του πλακούντα και να μελετήσουμε τον ρόλο του Erf στο έμβρυο, χρησιμοποιήσαμε ιστοειδικά ποντίκια στον επιβλάστη. Εδώ, αποδυκνύουμε ότι ο Erf απαιτείται και στα τρία κύματα αιματοποίησης του εμβρύου. Τα πρώτα αιματοποιητικά κύτταρα σχηματίζονται σε νησίδες αίματος στο λεκιθικό σάκο του εμβρύου την εμβρυϊκή ημέρα 7.5 (E7.5) και αποτελούν το πρωτόγονο κύμα αιμοποίησης (primitive wave). Αυτοί οι πρόδρομοι ερυθροβλάστες είναι τα κυρίαρχα κύτταρα στο αρχικώς κυκλοφορούν αίμα, τα οποία διαφοροποιούνται σε ερυθρά, μακροφάγα και μεγακαρυοκύτταρα. Λίγο μετά, την εμβρυϊκή ημέρα E8.25, παράγεται ένα δεύτερο κύμα αιμοποίησης στο λεκιθικό σάκο, που ονομάζεται οριστικό κύμα (definitive wave) και αποτελείται από τους ερυθρο- μυελοειδείς προγόνους (ΕΜΡ). Τα ΕΜΡs μεταναστεύουν στην κυκλοφορία του αίματος και τελικά αποικίζουν το εμβρυϊκό ήπαρ την εμβρυϊκή ημέρα Ε10.5. Ένα τρίτο κύμα αιματοποίησης που παράγεται την περιοχή της αορτής - γονάδας - μεσονεφρού (AGM) την E10.5, επίσης μεταναστεύει στην αρχή στο εμβρυϊκό ήπαρ και τέλος στο μυελό των οστών, όπου αποτελεί τα ενήλικα αιματοποιητικά βλαστοκύτταρα (HSC). Παρόλο που τα HSC μπορούν να βρεθούν στο λεκιθικό σάκο, το AGM φαίνεται να είναι η κύρια πηγή των ενήλικων HSCs. Τα ποντίκια που έχουν απαλείψει τον Erf στον επιβλάστη, εμφάνισαν σοβαρή αναιμία και πέθαναν στην εμβρυϊκή ημέρα (Ε) 14,5. Τα έμβρυα Erf - / - είχαν μειωμένα κύτταρα στην περιφέρεια από την E9.5 και μετά, τα οποία μειώθηκαν σημαντικά την Ε14.5. Η εξάλειψη του Erf είχε ως αποτέλεσμα μειωμένο αριθμό κυττάρων, τα οποία ήταν και τα πιο πρόδρομα κύτταρα του αίματος την E9.5-10.5 με βάση τεχνικών αιματοξυλίνης και ηωσίνης σε λεκιθικούς σάκους, μετρήσεις κυκλοφορούντων κυττάρων αίματος και real-time για τα επίπεδα μεταγραφής των αιμοσφαιρινών στο κυκλοφορούν αίμα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ένα ελάττωμα στο πρωτόγονο αιματοποιητικό κύμα (primitive wave). Επιπροσθέτως, μειωμένοι ερυθροειδείς-μυελοειδείς (EMP) πρόγονοι και αποικίες ερυθρών ανιχνεύθηκαν στο περιφερικό αίμα την Ε10.5 με τεχνικές κυτταρομετρίας ροής και δημιουργίας αποικιών προερχόμενων από το λεκιθικό σάκο. Η αιματοποίηση του ήπατος ήταν πρόβληματοκή με επίσης μειωμένους αριθμούς προδρόμων και πιο ώριμων κυττάρων και με ανεπαρκή διαφοροποίηση ερυθροβλαστών. Κυτταρομετρία ροής με ειδικούς δείκτες για διαφοροποίηση ερυθρών και η τεχνική σχηματισμού αποικιών επιβεβαίωσαν την αναποτελεσματική διαφοροποίηση των ερυθροβλαστών. Τέλος, ο Erf φαίνεται να είναι απαραίτητος για τη διατήρηση ή διαφοροποίηση των HSCs, όπως φαίνεται από την μειωμένη ικανότητα επαναπληθυσμού τους μετά από μεταμόσχευση σε ποντίκια (CRU). Επιπλέον, αποδεικνύουμε ότι τα μειωμένα επίπεδα του Erf προκαλούν κρανιοσυνοστέωση σε ανθρώπους και ποντίκια. Μεταλλάξεις του Erf βρέθηκαν σε ανθρώπους με κρανιοσυνοστέωση και η σπουδαιότητά τους μελετήθηκε με κλωνοποίηση μεταλλάξεων του Erf και προσδιορισμό τους με τη μέθοδο της λουσιφεράσης. Επιπλέον, ο Runx2, ένας πιθανός στόχος του Erf στην οστεογένεση, ο οποίος βρέθηκε από το Chip-seq, μελετήθηκε με συν-επιμόλυνση του Erf και Runx2 και τη μέθοδο λουσιφεράσης. Αποδεικνύουμε ότι η Erf επηρεάζει την αποτελεσματικότητα ολόκληρης της αιματοποίησης και της οστεογένεσης. Σε αυτό το πλαίσιο, ο Erf θα μπορούσε να αποτελέσει έναν ελκυστικό στόχο παρέμβασης.