Κυτταρογενετική και μοριακή διερεύνηση της αναιμίας fanconi

Abstract

Fanconi anaemia (FA) is a rare genetic disorder, characterised by progressive pancytopenia, variable congenital anomalies, susceptibility to malignancies and induced chromosomal instability. 15 subtypes are currently recognised and mutations of the FANCA gene account for more than 65% of FA cases. They all show autosomal recessive inheritance, with the exception of FA-B which is X-linked. The FANC proteins cooperate in the FA/BRCA pathway in order to repair DNA defects by homologous recombination.MaterialWe report on the results from a cohort of 177 patients, aged 2 months-40 years old referred to the Department of Medical Genetics of Athens University for genetic investigation after the clinical suspicion of FA. 79,1% were referred because of haematological abnormalities, 13,6% had haematological and various congenital anomalies while 7,3% patients had only haematological defects.Methods 1. Cytogenetic analysis: For clastogen-induced chromosome damage,cultures were set up with the addition of MMC and DEB, respectively. A sample was considered as FA positive if the percentage of breaks and radial formations detected were 7-10 times higher compared to an aged-matched control.2. Molecular analysis : A. Multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) was used for the detection of possible FANCA gene deletions. B. Mutation analysis was performed by Polymerase chain reaction (PCR) amplification followed by Enzymatic cleavage mismatch analysis (ECMA). Samples demonstrating heteroduplex formation were directly sequenced to allow characterization of molecular defects. Results1. Cytogenetic testing: In 16/177 patients induced breaks and radial formations were noted with both clustogens in 92% of analysed metaphases. 2. 12/16 belonged to FA-A subtype. A. Molecular analysis by MLPA revealed that 5/12 patients were classified as having the FA-A subtype.B. 8 were identified as having point mutations in the FANCA gene using the techniques PCR, ECMA and Sequencing.21/32 family members presented molecular alterations in the FANCA gene; 5 were heterozygotes for deletions of exons and 16 were carriers of point mutations.DiscusssionIn the present study 75% of FA patients belonged to the FA-A subtype. Molecular defects were identified for the first time in FANCA gene and further analysis followed. Family members diagnosed with heterozygosity for molecular defects of FANCA gene, had a child after prenatal diagnosis.

Εισαγωγή H αναιμία Fanconi (FA) είναι σπάνιο γενετικό νόσημα που μεταβιβάζεται με το σωματικό υπολειπόμενο χαρακτήρα ενώ σπανιότερα εμπλέκεται γονίδιο που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα Χ. Η μεγάλη ποικιλομορφία στον φαινότυπο των ασθενών με FA αντικατοπτρίζει την ετερογένεια της γενετικής βλάβης σε μοριακό επίπεδο. Μέχρι σήμερα έχουν βρεθεί 15 συμπληρωματικές ομάδες γονιδίων .Το είδος της μοριακής βλάβης συνδέεται άμεσα με την κατάταξη των ασθενών σε υποτύπους γεγονός που καθιστά επιτακτική την ανάγκη της ταυτοποίησης των μεταλλάξεων τόσο των ασθενών, όσο και των μελών της οικογένειάς τους. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο έλεγχος ασθενών για FA με κυτταρογενετικές και μοριακές τεχνικές και η ταξινόμησή τους σε υποτύπους, η ταυτοποίηση των πιο συχνών μεταλλάξεων στον ελληνικό πληθυσμό και η ανίχνευση φορέων των παθολογικών μεταλλάξεων των FA γονιδίων με εξέταση των γονέων των ασθενών και άλλων μελών της οικογένειας.ΥλικόΥλικό της παρούσας μελέτης αποτέλεσαν 177 ασθενείς ηλικιών 1 μηνός- 40 ετών οι οποίοι παραπέμφθηκαν στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής από τα παιδιατρικά νοσοκομεία της χώρας, καθώς και από κάποια νοσοκομεία ενηλίκων. 79,1% των ασθενών παραπέμφθηκαν εξαιτίας αιματολογικών προβλημάτων, 13,6 %παρουσίαζαν τόσο συγγενείς ανωμαλίες, όσο και δυσλειτουργία του μυελού των οστών και 7,3 % παρουσίαζαν μόνο συγγενείς ανωμαλίες.ΜέθοδοιΟι μέθοδοι που αξιοποιήθηκαν είναι : 1. Η κυτταρογενετική ανάλυση μετά από καλλιέργεια των λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος των ασθενών και μαρτύρων αντιστοίχου φύλου και ηλικίας παρουσία των μεταλλαξιογόνων παραγόντων ( μιτομυκίνη C (MMC) ή διεποξυβουτάνη (DEB) ) σε δύο διαφορετικά ζεύγη καλλιεργειών.2. Η μοριακή ανάλυση χρησιμοποιώντας:A. Την τεχνική Multiple Ligation Dependent Probe Amplification (MLPA) για την ταυτοποίηση ελλείψεων εξωνίων του γονιδίου FANCA οι οποίες ανιχνεύονται στο 65% περίπου των ασθενών B. Tην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), την τεχνική ECMA (Enzymatic Cleavage Mismatch analysis), καθώς και την αλληλούχηση της πρωτοταγούς δομής του DNA (sequencing) για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων, όπως αντικαταστάσεις, προσθήκες ή ελλείψεις βάσεων.Aποτελέσματα1. 16/177 ασθενείς παρουσίασαν αύξηση της συχνότητας χρωμοσωμικών θραυσμάτων, ανακατατάξεων και τρι και τετρακτινωτών σχηματισμών (triradials and tetraradials) σε ποσοστό 92% περίπου σε σχέση με τον μάρτυρα, τόσο μετά από προσθήκη MMC όσο και από DEΒ. 4/16 παρουσίασαν αυτόματα σπασίματα στα χρωμοσώματα, απουσία μεταλλαξιγόνου παράγοντα (MMC/ DEB).2. Σε 12/16 ταυτοποιήθηκαν μοριακές βλάβες στο γονίδιο FANCAΑ. Με την τεχνική MLPA 5/12 ασθενείς ταυτοποιήθηκαν στον υπότυπο FA-A. Β. Με τις τεχνικές PCR, ECMA και Sequencing, ταυτοποιήθηκαν σημειακές μεταλλάξεις στο γονίδιο FANCA σε 8/12 ασθενείς.21/ 32 συγγενείς των FA ασθενών, που ελέγχθηκαν ήταν φορείς μοριακών βλαβών του FANCA γονιδίου. 5 ήταν ετερόζυγοι για ελλείψεις των εξωνίων και 16 φορείς σημειακών μεταλλάξεων.Συζήτηση Η παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε ότι και στον Ελληνικό πληθυσμό το μεγαλύτερο ποσοστό των μοριακών βλαβών των ασθενών με FA εντοπίζεται στο γονίδιο FANCA. Ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά μεταλλάξεις στο FANCA και ακολούθησε μελέτη στον γενικό πληθυσμό, προκειμένου να διαλευκανθεί η παθογένειά τους. Διερεύνηση για τυχόν μεταλλάξεις σε συγγενείς των FA ασθενών, συνετέλεσε στην επιτυχή έκβαση εγκυμοσύνης μετά από προγεννητικό έλεγχο.