Μελέτη του οξειδωτικού stress στο μυοκάρδιο μετά από πειραματική πρόκληση ισχαιμίας/επαναιμάτωσης και η επίδραση του αντιοξειδωτικού παράγοντα U74389G (16-demesthyl tirilazad)

Abstract

Background: The adverse effects of myocardial ischemia and reperfusion during cardiopulmonary bypass (CPB) have been thoroughly described. Lazaroid U-74389G, a 21 aminosteroid, has been shown to attenuate ischemia and reperfusion injury and improve recovery in a variety of experimental models. Methods: Sixteen male swine were randomly divided in two groups. All animals underwent 45 minutes of ischemic cardioplegic arrest, with U-74389G addition to the standard cardioplegic solution, while controls underwent the same procedure without U-74389G. Creatine kinase-MB isoenzyme (CK-MB) and cardiac troponin T (cTnT) levels were measured immediately before CPB (time point 0), during the ischemic period (time point 1) and 30 (time point 2), 60 (time point 3) and 120 (time point 4) minutes following reperfusion. Myocardial biopsies were obtained at time points 0 and 4. Results: CK-MB levels (in U/l) at time points 0 to 4 were 205 [186-235] vs. 219 [196-269] (p=0.72), 215 [167-248] vs. 253 [193-339] (p=0.23), 234 [198-255] vs. 338 [249-441] (p=0.02), 244 [217-272] vs. 354 [269-496] (p=0.01), and 285 [230-321] vs. 439 [432-530] (p<0.01) in lazaroid-treated animals vs. controls, respectively. cTnT levels (in ng/l) at time points 0 to 4 were 58 [26-287] vs. 237 [26-395] (p=0.72), 129 [61-405] vs. 265 [145-525] (p=0.23), 261 [123-467] vs. 474 [427-1604] (p=0.04), 417 [204-750] vs. 841 [584-1818] (p=0.11), and 643 [353-1259] vs. 1600 [1378-2313] (p<0.01), respectively. Necrosis grades at time point 4 were 0.0 [0.0-1.0] vs.1.5 [1.0-2.0] (p<0.01) in lazaroid-treated animals vs. controls, respectively. Conclusion: The present study, in addition to reconfirming the well-described adverse effects of CPB, demonstrates the efficacy of the newer generation lazaroid U-74389G in alleviating these effects.Keywords: lazaroid; U-74389G; ischemia; reperfusion; cardiopulmonary bypass; swine model; open chest

Η καρδιοχειρουργική βασίζεται στην άρτια χειρουργική τεχνική και την αποφυγή τραυματικών βλαβών που προκύπτουν απο τους χειρισμούς ή τις μεθόδους μυοκαρδιακής προστασίας. Ακόμη και μία άψογη τεχνικά επέμβαση μπορεί εντέλει να οδηγηθεί σε αποτυχία εάν και εφόσον οι περιβάλλοντες ιστοί έχουν υποστεί εκτεταμένη βλάβη. Σε μοριακό επίπεδο και επί χειρουργικού εδάφους η ανάπτυξη δραστικών ριζών οξυγόνου και αζώτου συμβάλλουν τα μέγιστα στην πρόκληση βλαβών του μυοκαρδίου, με την βλάβη να έπερχεται μέσω μίας ακολουθίας, η οποία εμπεριέχει τόσο οξείδωση μακρομορίων (πρωτεϊνών, λιπιδίων, νουκλεϊκών οξέων), όσο και βλάβη των μιτοχοδρίων.Το λαζαροειδες U-74389G, της οικογένειας των 21-αμινοστεροειδών έχει την δυνατότητα να περιορίζει την μεμβρανική λιπιδική υπεροξείδωση μέσα από την δέσμευση λιπιδιακών υπεροξειδικών ριζών, ενώ επιπρόσθετα διαθέτει και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες, καθόσον όχι μόνο περιορίζει την απελευθέρωση TNF-a και ιντερλευκίνης 6 από τα κύτταρα Kupffer, αλλά και αναστέλλει την caspase-1. Κάτω από πειραματικές συνθήκες η αναστολή της λιπιδιακής υπεροξείδωσης με τα 21-αμινοστεροειδή έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει την ανάρρωση σε σειρά οργάνων, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου. Αναφορικά με την καρδιά, υπάρχουν αρκετά ευρήματα/αναφορές, τα οποία υποστηρίζουν θετικές επιδράσεις τόσο στην καρδιακή λειτουργία και ιστολογία, όσο και στην λειτουργία του ενδοθηλίου, μέσα από την δέσμευση ελευθέρων ριζών. Οι περισσότερες εκ των μελετών είχαν ως σκοπό να δημιουργήσουν συνθήκες οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου ή και εγχείρισης μεταμόσχευσης καρδιάς για να απομονώσουν τον μοριακό κυτταροπροστατευτικό μηχανισμό των λαζαροειδών. Εμείς επιδιώξαμε να δημιουργήσουμε συνθήκες “real life” μυοκαρδιακής προστασίας με καρδιοπληγία προκειμένου να διαπιστώσουμε εάν και κατά πόσον το lazaroid U-74389G μπορεί να αμβλύνει τις βλάβες που δημιουργούνται σε μια τυπική καρδιοχειρουργική επέμβαση όπως για παράδειγμα η αορτοστεφανιαία παράκαμψη με την κλασική μέθοδο της εξωσωματικής κυκλοφορίας και της καρδιοπληγικής καρδιακής παύσης.ΜΕΘΟΔΟΙ.Το πειραματικό πρωτόκολλό μας πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις της Φαρμακοβιομηχανίας ELPEN μετά απο έγκριση της κατά τόπον αρμόδιας Επιτροπής Ηθικής, ενώ στα συμμετέχοντα ζώα παρασχέθηκε η προβλεπόμενη στην Οδηγία 2016/63 φροντίδα.ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΖΩΩΝ ΚΑΙ ΤΥΧΑΙΟΠΟΙΗΣΗ. Η μελέτη/πείραμα συμπεριέλαβε δεκαέξι αρσενικούς οικόσιτους χοίρους, σωματικού βάρους 25 - 35 Kg. Έκαστο ζώο στα πλαίσια του εγκλιματισμού του απομονώθηκε σε ξεχωριστό χώρο με απεριόριστη πρόσβαση σε φαγητό και νερό επί τουλάχιστον πενθημέρου πριν την έναρξη της διαδικασίας. Τα ζώα διαχωρίστηκαν με τυχαιοποιημένη κατανομή, εν αγνοία των ερευνητών/μελετητών, σε δύο διαφορετικές ομάδες, ήτοι την ομάδα Α (lazaroid group, n-8) και την ομάδα Β (control group, n-8). ΔιαλύματαΤο διάλυμα βάσης παρασκευάσθηκε προσθέτοντας 4.2 mg/ml citric acid monohydrate, 0.5 mg/ml sodium citrate decahydrate και 1.8 mg/ml sodium chloride σε 480 ml water for injection. Κατόπιν το διάλυμα τοποθετήθηκε σε λουτρό υπερήχων μέχρι πλήρους διαλύσεως. Το διάλυμα λαζαροειδούς παρασκευάσθηκε προσθέτοντας 10 mg U-74389G ανά kg σωματικού βάρους των πειραματόζωων στο διάλυμα βάσης. Όλες οι διαδικασίες τυχαιοποιημένης κατανομής των ζώων και προετοιμασίας των φαρμάκων έλαβαν χώρα με μέριμνα των τεχνικών υπαλλήλων της οικείας εγκατάστασης και εν αγνοία των μελετητών/ερευνητών. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟΚατόπιν ολονύχτιας στέρησης τροφής, αλλά με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό οι χοίροι έλαβαν προνάρκωση αποτελούμενη από ενδομυικά χορηγηθείσα κεταμίνη (20 mg/kg), μινταζολάμ (0,66mg/kg) και ατροπίνη (0,04 mg/kg) και οδηγήθηκαν στο χειρουργείο. Τοποθετήθηκε περιφερειακός φλεβικός καθετήρας και η αναισθησία χορηγήθηκε με bolus έγχυση προποφόλης (1-3mg/kg), φαιντανύλης (0,0025mg/kg) και cisatracurium (0,5mg/kg). Ακολούθως τα ζώα διασωληνώθηκαν με ενδοτραχειακούς σωλήνες διαμέτρου 7-7,5 mm και τους τοποθετήθηκε μηχανικός αναπνευστήρας, ρυθμισμένος σε τέτοια επίπεδα Αναπνευστικής Συχνότητας (respiratory rate) και Αναπνεόμενου Όγκου (tidal volume), ούτως ώστε οι τιμές του pH, PaO2 και PaCO2 στο αρτηριακό αίμα να παραμείνουν σε φυσιολογικά επίπεδα (PaO2>80mmHg, PaCO2=35-45mmHg, pH= 7.35-7.45). Η θερμοκρασία, κατά περίπτωση ακόμη και με την χρήση εξωτερικής θέρμανσης, διατηρήθηκε ενδοτραχειακά μεταξύ 37,5 0C και 39,0 0C. Οι δε απώλειες υγρών αναπληρώθηκαν αρχικά με την ενδοφλέβια χορήγηση διαλύματος Ringer΄s Lactate (500 ml) και κατόπιν με την χορήγηση φυσιολογικού ορού σε ρυθμό ροής περί των 10ml/Kg/H, ούτως ώστε να διατηρηθεί η Κεντρική Φλεβική Πίεση σε φυσιολογικά επίπεδα (0-5 mmHg). Η αρτηριακή πίεση υποστηρίχθηκε, μέσω έγχυσης υπερογκωτικών διαλυμμάτων (Gelofusine colloid solution). Καθόλη την διάρκεια της διαδικασίας χορηγείτο ενδοφλεβίως προποφόλη (10-20mg/kg/h), φαιντανύλη (6-10mg/kg/h) και cisatracurium (1-2mg/kg/h) για να διατηρηθεί η αναισθησία και η αναλγησία.Με συνθήκες αντισηψίας/αποστείρωσης και προς διευκόλυνση της συνεχούς παρακολούθησης της Κεντρικής Φλεβικής Πίεσης (ΚΦΠ) και της Μέσης Αρτηριακής Πίεσης (ΜΑΠ) παρασκευάσθηκαν η δεξιά σφαγίτιδα φλέβα και η καρωτίδα, αντιστοίχως. Επιπρόσθετη παρακολούθηση συμπεριέλαβε συνεχές ηλεκτροκαρδιογράφημα 5 απαγωγών και ένα πρωκτικό ηλεκτρόδιο για την θερμομέτρηση του πυρήνα του σώματος. Για να προληφθούν τυχόν ατυχήματα/επιπλοκές οφειλόμενα στο μικρό μέγεθος της αορτής των χοίρων εξασφαλίστηκε πρόσβαση στο κύκλωμα καρδιοπνευμονικής παράκαμψης (CPB), μέσω της κοιλιακής αορτής και της κάτω κοίλης φλέβας. Για αυτόν τον σκοπό πραγματοποιήθηκε μία μέση κατώτερη λαπαροτομία. Αυτή η προσέγγιση σωρευτικά με την διασφάλιση πρόσβασης στα προαναφερθέντα αγγεία διευκόλυνε τον καθετηριασμό της ουροδόχου κύστεως, επιτρέποντας την παρακολούθηση της ούρησης. Η προετοιμασία της κοιλιακής αορτής και της κάτω κοίλης φλέβας πραγματοποιήθηκαν αφού προηγουμένως είχε χορηγηθεί αντιθρομβωτική αγωγή με ενδοφλέβια έγχυση 5000 I.U. μη κλασματοποιημένης ηπαρίνης (UFH). H σύνδεση με το κύκλωμα της εξωσωματικής κυκλοφορίας επιτεύχθηκε με την εισαγωγή μίας 22-Fr. (8.0mm) X 15cm (6’’) Edwards Lifesciences κάνουλας στην κοιλιακή αορτή RC022, μίας 26 ή 28-Fr. (9.3mm) x35cm (14”) Edwards Lifesciences κάνουλας στην κάτω κοίλη φλέβα (TF026L ή TF028L) και ενός 7-Fr. Medtronic DLP 14Ga καθετήρα διπλού αυλού στην ανιούσα αορτή, ο οποίος χρησιμοποιήθηκε για την χορήγηση της κλασικής καρδιοπληγίας ή/και του διαλύματος λαζαροειδούς και ρυθμιστικού διαλύματος. Επιπρόσθετα ένας χειροκίνητα διογκούμενος καθετήρας Edwards Lifesciences 9 Fr. (3.0mm) x 20 cm (8 “) (RC09) εισήχθη στον στεφανιαίο κόλπο μεσα από τον καρδιακό κόλπο, ούτως ώστε να λαμβάνονται δείγματα αίματος. Απαιτήθηκε η ενδοφλέβια έγχυση bolus 100-200 I.U/kg μη κλασματοποιημένης ηπαρίνης (UFH) προκειμένου να επιτευχθεί ενεργοποιημένος χρόνος πήξης (ACT) > 480 sec και τα ζώα συνδέθηκαν στο κύκλωμα καρδιοπνευμονικής παράκαμψης (CPB) (Stöckert, Germany), με την standard ρύθμιση/διευθέτηση, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης Sorin Synthesis οξυγονωτή (SORIN). Το σύστημα είχε προηγουμένως προετοιμαστεί με διαλύματα: Ringer΄s Lactate 500 ml, Gelofusine 500 ml, Μαννιτόλη 20% 500 mg/Kg, καθώς και 3000 I.U. μη κλασματοποιημένης ηπαρίνης (UFH).Μετά την έναρξη της εξωσωματικής κυκλοφορίας και τη συστηματική μέτρια υποθερμία των 32 0C το περιφερικό τμήμα της ανιούσας αορτής αποκλείεται (cross-clamped) και ξεκινά η χορήγηση της καρδιοπληγίας, για την οποία χρησιμοποιήθηκε διάλυμα St. Thomas΄ Hospital αναμεμιγμένο με αίμα (400ml, σε αναλογία 3:1). Η διαδικασία αυτή είναι ακριβής προσομοίωση της χρησιμοποιούμενης σε ανθρώπους. Επιπροσθέτως συμφώνως προς το standard πρωτόκολλο της καρδιοπληγίας χορηγήθηκαν (αναλόγως της τυχαιοποίησης των ζώων), είτε 120 ml lazaroid σε ρυθμιστικό διάλυμα (buffer), είτε μόνο ρυθμιστικό διάλυμα (buffer). Μετά από 15 και 30 λεπτά πραγματοποιήθηκε έγχυση 200 ml standard διαλύματος για την καρδιοπληγία από κοινού με 60 ml κατάλληλου διαλύματος, ενώ 45 λεπτά μετά τον αποκλεισμό της αορτής αφού χορηγήθηκαν, αυτή την φορά όμως στην συστηματική κυκλοφορία μέσω της σφαγίτιδας, εκ νέου 120 ml lazaroid σε ρυθμιστικό διάλυμα (buffer), είτε μόνο ρυθμιστικό διάλυμα (buffer), σταμάτησε ο αποκλεισμός της αορτής και τα ζώα σταδιακά αναθερμάνθηκαν στους 37 0C για 15 λεπτά περίπου. Η εξωσωματική κυκλοφορία/εξωσωματικό κύκλωμα διεκόπη και μετά από 120 λεπτά επαναιμάτωσης επήλθε καρδιακή ανακοπή με την έγχυση χλωριδίου του ποτασίου στην αριστερή κοιλιακή κοιλότητα. Καθόλη την διάρκεια της καρδιοπνευμονικής παράκαμψης ο ενεργοποιημένος χρόνος πήξης (ACT) διατηρήθηκε άνω των 480 sec. Όλα τα ζώα έτυχαν της ίδιας μεταχείρισης. Αιμοδυναμικοί παράμετροι, αιμοληψία και δείγματα ιστών. Στην αρχή του πειραματικού πρωτοκόλλου (time point 0) ακριβώς πριν την καρδιοπνευμονική παράκαμψη (bypass) και την εισαγωγή σε υποθερμία, πραγματοποιήθηκε αιμοληψία από την καρωτιδική αρτηρία, την σφαγίτιδα φλέβα και τον στεφανιαίο κόλπο, ενώ ελήφθη και δείγμα μυοκαρδίου προς βιοψία, η οποία και πραγματοποιήθηκε με αφαίρεση περί των 2Χ2Χ2 mm ιστού από το τοίχωμα της αριστερής κοιλίας με νυστέρι No 15, με ταυτόχρονη τοποθέτηση 5-0 prolene ραμμάτων για την αποφυγή αιμορραγίας. Εξήντα λεπτά αργότερα (45 μετά τον αποκλεισμό της αορτής), και λίγο πριν την ολοκλήρωση του ισχαιμικού επεισοδίου πραγματοποιήθηκε και νέα αιμοληψία (time point 1). Κατά την διάρκεια της επαναιμάτωσης έλαβαν χώρα διαδοχικές αιμολήψίες στα 30, 60 και 120 λεπτά μετά την διακοπή του αποκλεισμού της αορτής (time points 2, 3 και 4 αντιστοίχως), ενώ ελήφθησαν και δείγματα ιστού (time point 4). Καθόλη την διάρκεια της διαδικασίας παρακολουθήθηκε και καταγράφηκε η Μέση Αρτηριακή Πίεση (ΜΑΠ). Οι αρτηριακές αιμοληψίες χρησιμοποιήθηκαν για την εξέταση των αερίων του αίματος (pH, PaO2 and PaCO2), ενώ οι αντίστοιχες φλεβικές για την μέτρηση των επιπέδων/τιμών του νατρίου (Na+), του ποτασίου (K+), της αιμοσφαιρίνης (Hb), της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST), της αμινοτρανσφεράσης αλανίνης (ALT), της κρεατινικής κινάσης (CK), του ισοενζύμου ΜΒ της κρεατινικής κινάσης (CK-MB) και της καρδιακής τροπονίνης Τ (cTnT). Οι αιμοληψίες από τον στεφανιαίο κόλπο χρησιμοποιήθηκαν για την μέτρηση: CK, CK-MB και cTnT. Τα δείγματα βιοψιών χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική ανάλυση. Διάγραμμα της παρέμβασης απεικονίζεται στο Σχήμα 1.ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ. Τα ιστολογικά δείγματα έτυχαν ανάλογης μεταχείρισης με τα αντίστοιχα από το μυοκάρδιο, ως ανωτέρω ήδη αναλύθηκε. Εν συντομία τοποθετήθηκαν κατευθείαν σε 10% διάλυμα ουδέτερης φορμόλης σε θερμοκρασία δωματίου προς αποφυγή contraction band artefacts (δέσμης συστολικών τεχνουργημάτων). Μετά από την standard ιστολογική προετοιμασία, συμπεριλαμβανομένης της εμπέδωσης σε κερί παραφίνης, τα δείγματα τεμαχίστηκαν με μικροτόμο σε πάχος 4-6 μm και τοποθετήθηκαν σε γυάλινα slides, ο αριθμός των οποίων ανήλθε σε συνολικά 15, τα οποία και συμπεριέλαβαν ολόκληρο το ιστολογικό δείγμα. Τα δείγματα έλαβαν διαδοχική αρίθμηση. Στα Slides 6 and 14 πραγματοποιήθηκε χρώση με την ελαστική τρίχρωμη τεχνική για την εμφάνιση ελαστικών και κολλαγόνων ινών, ενώ στα υπόλοιπα πραγματοποιήθηκε χρώση με αιματοξυλίνη και ιωσίνη για την αποτύπωση των ιστομορφολογικών χαρακτηριστικών. Τα δείγματα εκτιμήθηκαν για συγκεκριμένα ευρήματα, ήτοι για την εμφάνιση contraction band artefacts (δέσμη συστολικών τεχνουργημάτων), την παρουσία πολυμορφο-πύρηνων λευκοκυττάρων, την απώλεια εγκάρσιων ραβδώσεων, την ύπαρξη οιδήματος και μικροσκοπικής αιμορραγίας. Προς τούτο χρησιμοποιήθηκε μικροσκόπιο Nikon eclipse 50i και μεγεθυντικοί φακοί 100-fold, 250-fold και 400-fold. Τα ευρήματα βαθμολογήθηκαν από το 0 έως το 3, αναλόγως του βαθμού των αλλοιώσεων, ήτοι 0 όταν δεν έχουν επέλθει καθόλου αλλοιώσεις, 1 στις περιπτώσεις περιορισμένων αλλοιώσεων, 2 στην παρατήρηση μετρίου βαθμού εμφάνισης πολυμορφο-πύρηνων λευκοκυττάρων και 3 στις περιπτώσεις σοβαρών αλλοιώσεων. Εντέλει έκαστο ιστολογικό δείγμα βαθμολογήθηκε για κάθε ένα από τα ήδη περιγραφέντα ευρήματα επί τη βάσει του μέσου όρου βαθμολόγησης των αντίστοιχων slides με στρογγυλοποίηση προς τον πλησιέστερο ακέραιο αριθμό. Ο παθολογοανατόμος δεν ήταν ενήμερος για την ακολουθηθείσα θεραπεία. Στατιστική Ανάλυση. Στις μετρήσεις που εμφάνισαν συνεχείς διακυμάνσεις καταγράφηκε ο μέσος όρος τους [25η-75ή εκατοστιαία μονάδα] και συγκρίθηκαν με την χρήση του Mann-Whitney U test, ενώ οι σταθερές μετρήσεις αποτυπώθηκαν ως αθροίσματα (ποσοστά) και συγκρίθηκαν με το Fisher’s exact test. Ο υπολογισμός των περιοχών κάτω από τις καμπύλες των δεικτών του κατεστραμμένου μυοκαρδίου πραγματοποιήθηκε επί τη βάσει των γραφικών απεικονίσεων των προοδευτικών συγκεντρώσεων με την χρήση του τραπεζοειδούς κανόνα. Για το σύνολο των αναλύσεων χρησιμοποιήθηκαν η SPSS 22 (IBM Corp.) και R language (εκδοχή 3.2.3). ΑποτελέσματαΌλα τα ζώα αποσυνδέθηκαν επιτυχώς από την αντλία καρδιοπνευμονικής παράκαμψης, ενώ και οι δύο πειραματικές ομάδες κατά την διάρκεια της παράκαμψης εμφανίστηκαν αιμοδυναμικά ισοδύναμες. Κατά την διάρκεια του by pass ο μέσος όρος της τμηματικής πίεσης οξυγόνου ήταν στην ομάδα λαζαροειδούς (ομάδα Α) 223 [168-325], ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 248 [202-274] (p=0.721), και ο μέσος όρος της τμηματικής πίεσης του διοξειδίου του άνθρακα ήταν στην ομάδα λαζαροειδούς (ομάδα Α) 31 [28-54] mmHg, ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 36 [33-49] mmHg (p=0.505). Ακολούθως δύο ώρες μετά το καρδιοπνευμονικό by pass η μέση συστολική πίεση ήταν στην ομάδα λαζαροειδούς (ομάδα Α) 110 [95-120], ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 115 [110-115] mmHg (p=0.279). Τριάντα (30) λεπτά μετά την επαναιμάτωση και μέχρι το πέρας του πειράματος (time points 2 έως 4) τα επίπεδα CK-MB και cTnT, όπως αυτά αποτυπώνονται στον Πίνακα 1, ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα που δεν χορηγήθηκε λαζαροειδές (ομάδα Β). Οι τιμές του CPK ακολούθησαν το ίδιο μοτίβο.Ο συνολικός δείκτης αποτελέσματος (προσδιορισθείς ως η περιοχή κάτωθι της καμπύλης των συγκεντρώσεων CK-MB και cTnT καθόλη την διάρκεια του πειράματος) ήταν επίσης σημαντικά χαμηλότερος στην ομάδα που χορηγήθηκε lazaroid σε αντίθεση με την άλλή ομάδα. Ειδικότερα τώρα στην ομάδα lazaroid (ομάδα Α) η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης CK-MB ήταν 46133 [38145-52472] μονάδες, ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 62314 [53430-87101] μονάδες. Επίσης στην ομάδα λαζαροειδούς (ομάδα Α) η περιοχή κάτω από την καμπύλη συγκέντρωσης cTnT ήταν 56 [31-127] μονάδες, ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 124 [105-272] μονάδες (Σχήμα 2). Σε σχέση με την ηπατική λειτουργία, η ασπαραγινική τρανσαμινάση (AST) ήταν σε γενικές γραμμές υψηλότερη στην ομάδα που δεν χορηγήθηκε λαζαροειδές (Σχήμα 3), αν και θα πρέπει να επισημανθεί ότι μόνο στο time point 4 η διαφορά υπήρξε στατιστικά σημαντική (p=0.02). Το ίδιο ίσχυσε και για τα επίπεδα της τρανσαμινάσης της αλανίνης (ALT), με τις σημαντικές διαφοροποιήσεις να σημειούνται στα time points 2 (p=0.04) και 4 (p<0.01).Ο μέσος βαθμός νέκρωσης στο time point 4 στην ομάδα λαζαροειδούς (ομάδα Α) ήταν 0.0 [0.0-1.0] ενώ στην άλλη ομάδα (ομάδα Β) 1.5 [1.0-2.0], (p<0.01) (Σχήμα 4).Συζήτηση.Η μελέτη μας κατέδειξε ότι η χορήγηση λαζαροειδούς μετά το standard διάλυμα για την καρδιοπληγία είναι εφικτή και ασφαλής, συνοδεύεται δε από μειωμένη βλάβη του μυοκαρδίου συνεπεία επαναιμάτωσης μετά από ισχαιμία, όπως ρητά αυτό αποτυπώνεται, τόσο στο προφιλ του καρδιακού δείκτη, όσο και στην ιστολογία της αριστερής κοιλίας. Η βλάβη που προκαλείται από την χειρουργική επαναιμάτωση μετά από ισχαιμία διακρίνεται περαιτέρω σε τρία στάδια: Η ΄΄αναστρέψιμη ισχαιμία΄΄ ή ΄΄μη προστατευτική ισχαιμία΄΄, η οποία επιβραδύνεται πριν την εισαγωγή του καρδιοπνευμονικού bypass ή την χρήση του διαλύματος για την καρδιοπληγία και εξαρτάται από το προχειρουργικό status/κατάσταση της ασθένειας/νόσου. Η ΄΄προστατευτική ισχαιμία΄΄, η οποία προκαλείται κατ΄επιλογήν/προαιρετικά με χημική καρδιοπληγία. Η βλάβη από την επαναιμάτωση διατηρείται καθόλη την διάρκεια της διακοπτόμενης έγχυσης διαλύματος για την καρδιοπληγία, μετά την αφαίρεση του αορτικού cross-clamp ή μετά την διακοπή του καρδιοπνευμονικού bypass. Η καρδιοπληγία προσφέρει επιλεκτική αιμάτωση της καρδιάς και επιτρέπει την διαχείριση παραγόντων, οι οποίοι μπορεί και να μην γίνονται ανεκτοί από τα άλλα όργανα δίχως επιπλοκές (π.χ. υπόταση). Λειτουργεί καρδιοπροστατευτικά με το να διαμορφώνει τις συνθήκες της επαναιμάτωσης, αλλά και την σύνθεση της. Εξαιτίας του αδιαμφισβήτητης διασύνδεσης μεταξύ της ισχαιμίας και της βλάβης από επαναιμάτωση η καρδιοπληγία καταφέρνει και λειτουργεί ευεργετικά κατά την διάρκεια και των δύο σταδίων. Απόπειρες δημιουργίας ενός διαλύματος για την καρδιοπληγία με επαρκή/αποτελεσματική κυτταροπλαστική λειτουργία έχουν να επιδείξουν φτωχά αποτελέσματα. Πριν από 20 χρόνια, χρησιμοποιώντας διάφορα είδη μικρόσωμων ζώων (αρουραίους και λαγούς) στα πειράματα τους, οι Nishida et al., Duguay et al. και Perna et al. ήταν οι πρώτοι που ανέφεραν ότι η θεραπεία με λαζαροϊδές μείωσε την βλάβη του μυοκαρδίου και του ενδοθηλίου, η οποία σχετίζεται με την μεταμόσχευση καρδιάς. Παρόμοιες αναφορές προήλθαν από τους Takahasi et al. με την χρήση ωστόσο κυνών ως πειραματικών μοντέλων, ενώ οι Ryan et al., χρησιμοποιώντας χοίρους υποβληθέντες σε ορθοτοπική μεταμόσχευση καρδιάς, κατέδειξαν βελτιώσεις στους δείκτες λειτουργικότητας της αριστερής κοιλίας. Επίσης οι Ngo et al. μελέτησαν τις συνέπειες της χορήγησης lazaroid, συνοδευόμενης, μετά από χρονικό διάστημα τριών εβδομάδων, από ex-vivo καδιοπληγία και 30 λεπτά επαναιμάτωσης, σε αρουραίους με πλήρως αποφραγμένο αριστερό πρόσθιο κατιόντα κλάδο. Οι συγγραφείς του παρόντος κατέληξαν στον συμπέρασμα ότι η χρήση U-74389G μπορεί να αναστρέψει την, σχετιζόμενη με χρόνιο έμφραγμα του μυοκαρδίου, στεφανιαία δυσλειτουργία, με την ρητή επισήμανση ότι όταν σε αυτή προστίθεται οξύ ισχαιμικό στρες, απαιτούνται επιπρόσθετα προστατευτικά μέτρα.Στην μελέτη μας επιδιώξαμε να δημιουργήσουμε συνθήκες “real life” καρδιοπληγίας, καθώς και να εξασφαλίσουμε την δυνατότητα πραγματοποίησης σειράς αιματολογικών και ιστολογικών εξετάσεων, από κοινού με την χρήση ενός standard συστήματος καρδιοπνευμονικού bypass (CPB), ευχέρεια που μας παρείχε η επιλογή μεγαλόσωμου πειραματικού μοντέλου (χοίρων) με παρεμφερή ανατομικά χαρακτηριστικά και φυσιολογία με αυτά της ανθρώπινης καρδιάς. Η έκθεση του αίματος στη μη ενδοθηλιακή επιφάνεια του συστήματος/κυκλώματος του καρδιοπνευμονικού bypass (CPB) από κοινου με την ισχαιμία έχουν ως αποτέλεσμα την εκκίνηση πολλαπλών διαδικασιών, οι οποίες ΄΄πυροδοτούν΄΄ κυτταρικούς και χυμικούς μηχανισμούς άμυνας. Η ενεργοποίηση των ουδετεροφίλων από κοινού με εκκρινόμενες ουσίες από τον δέκτη, συμπεριλαμβανομένων ορμονών, χημοκιών, κυτοκινών, αγγειοενεργών πεπτιδίων, δραστικών μορφών οξυγόνου, και πρωτεασών των μηχανισμών πήξης του αίματος και των ινωδολυτικών μηχανισμών, εντέλει οδηγούν σε βλάβη του μυοκαρδίου. Προκειμένου να υπολογίσουμε την, συνολικώς και καθόλη την διάρκεια της διαδικασίας, προκληθείσα βλάβη στο μυοκάρδιο χρησιμοποιήσαμε την περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUC) της τροπονίνης Τ (cTnT) και της κρεατινικής φωσφοκινάσης (CK-MB), αμφότερες των οποίων αποτελούν αποτελεσματικούς δείκτες βλάβης του μυοκαρδίου. Αποδείξαμε ότι η θεραπεία με λαζαροειδές U-74389G οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση της περιοχής κάτω από την καμπύλη (AUC) αμφότερων αυτών των ενζύμων. Τα αποτέλεσματα γίνονται ακόμη πιο εντυπωσιακά αν ληφθεί υπόψη ο σχετικά μικρός ισχαιμικός χρόνος (CPB διάρκειας 75 min) και το γεγονός ότι η ανάλυση της καρδιακής τροπονίνης TnT, η οποία χρησιμοποιήθηκε δεν ετύγχανε υψηλής ευαισθησίας. Είναι δε προφανές ότι και έτεροι παράγοντες, εκτός του κυκλώματος/συστήματος καρδιοπνευμονικού bypass, στους οποίους θα πρέπει να συμπεριληφθεί η χειρουργική μεταχείριση της καρδιάς (π.χ. η τοποθέτηση ραμμάτων) και ακόμη και η ενδοτοξαιμία, συνεισφέρουν και καθορίζουν την τελική εκταση της ζημιάς. Μικροσκοπικά οι αλλαγές στην μορφολογία των υγιών ιστών του μυοκαρδίου, οι οποίες προκλήθηκαν κατά την διάρκεια του bypass έχουν από την αρχή ακόμη της όλης διαδικασίας επισημανθεί και περιγραφεί. Δεδομένης της απουσίας ενός ευρύτερης αποδοχής συστήματος βαθμολόγησης/αξιολόγησης για την εκτίμηση και ποσοτικοποίηση της έκτασης των ιστολογικών μεταβολών υιοθετήσαμε/εισαγάγαμε μία ημι-ποσοτικοποιημένη προσέγγιση, η οποία ενσωματώνει τα συχνότερα απαντώμενα μικροσκοπικά ευρήματα.