Η επίδραση της απροτινίνης στη σπλαχνική ισχαιμία – επαναιμάτωση από πνευμοπεριτόναιο: πειραματική μελέτη σε επίμυες

Abstract

The study of the pathophysiological effects of pneumoperitoneum in the circulatory system, respiratory system and especially splanchnic circulation resulted in numerous publications mainly in the 90s. Μeasurements of blood flow in the branches of the abdominal aorta showed a decrease, which was proportional to intraabdominal pressure. Either high intraabdominal pressure or atherosclerosis and stenoses of blood vessels may lead to more severe splanchnic ischemia, followed by the phase of reperfusion after pneumoperitoneum discontinuation. Therefore, it is argued that elevated intra-abdominal pressure during insufflation activates the mechanisms of ischemia - reperfusion syndrome.Ischemia - reperfusion syndrome includes pathophysiological changes induced by reperfusion of tissues being previously under ischemia. The primary step in the sequence of these processes is the production of free radicals, which have a direct toxic effect on the cells and trigger the inflammatory response. Ischemia – reperfusion syndrome in liver occurs frequently in clinical practice either due to vascular occlusion during hepatectomy or within hepatic transplantation. The reperfusion injury in the small intestine causes intestinal barrier disruption and migration of bacteria and endotoxins from the intestinal lumen into the portal and then the systemic circulation. The final induction of systemic inflammatory response (SIRS) involves the damage of distant organs (remote injury) and progression to multiple organ dysfunction syndrome (MODS).Aprotinin, a protease inhibitor, has been used in experimental protocols of ischemia - reperfusion with beneficial effects. The anti-inflammatory and antioxidant effects of aprotinin mainly lies on the reduction of the expression of adhesion molecules in the endothelium, the degradation of elastase and cathepsin, the reduced production of myeloperoxidase and phospholipase D by neutrophils and finally the decreased production of proinflammatory cytokines.We used 60 male Albino Wistar rats, which were randomly divided into three groups of 20 animals each. Τhe first was the Sham group. In the second group (Control group, C) pneumoperitoneum with constant pressure of 12mm Hg was maintained for 4 hours. In the third group (Aprotinin group, AP), 4 hour pneumoperitoneum was produced and also aprotinin was administered intraperitoneally in a similar dosage to that used in cardiac surgery. Control and aprotinin groups were randomly divided into two subgroups of 10 animals each with different duration of reperfusion (60 or 180 minutes). Hence subgroups were named as C60, C180, AP60 and AP180. Sacrifice of the rats followed. After middle abdominal and thoracic incision, blood was taken from the heart. Liver, small intestine and lung specimens were collected. Biochemical markers measured were: TNF- a, IL-6, ET-1, CRP, prooxidant – antioxidant balance (PAB) and carbonylated proteins. Hematoxylin - eosin staining was performed for the histological examination and various characteristics of inflammation were evaluated by two pathologists using a five-point scale. The values of most biomarkers in liver were significantly lower in aprotinin subgroups (at least in one or both of them). This result was confirmed by histological examination of liver specimens, since the lesions in animals given the drug were milder, particularly in AP180 subgroup. In the small intestine there was no clear biochemical result in favor of aprotinin. However, in the intestinal specimens inflammation of the small intestine was significantly lower in aprotinin groups. In the lung, both AP60 and AP180 subgroups exhibited milder inflammatory reaction. Finally, plasma measurements showed no difference between groups.In conclusion, aprotinin seems to reduce tissue damage caused by splachnic ischemia - reperfusion induced by pneumoperitoneum. This result, combined with the results of other similar experimental protocols, could be a forerunner for the design of clinical studies in order to investigate the anti-inflammatory effect of the compound in humans.

Η μελέτη των παθοφυσιολογικών επιδράσεων του πνευμοπεριτοναίου στο κυκλοφορικό, στο αναπνευστικό και στη σπλαχνική κυκλοφορία οδήγησε σε πληθώρα δημοσιεύσεων κυρίως κατά τη δεκαετία του ’90. Oι μετρήσεις της αιματικής ροής στους κλάδους της κοιλιακής αορτής ανέδειξαν ελάττωση αυτής σε βαθμό ανάλογο της ενδοκοιλιακής πίεσης που εφαρμόζεται. Είτε σε υψηλές ενδοκοιλιακές πιέσεις είτε σε ασθενείς με αθηρωμάτωση και στενώσεις των αγγείων, το πνευμοπεριτόναιο οδηγεί σε σοβαρότερη σπλαχνική ισχαιμία, η οποία ακολουθείται από τη φάση της επαναιμάτωσης κατά την άρση του. Συνεπώς, υποστηρίζεται ότι το πνευμοπεριτόναιο ενεργοποιεί τους μηχανισμούς του συνδρόμου ισχαιμίας – επαναιμάτωσης. Το σύνδρομο ισχαιμίας – επαναιμάτωσης περιλαμβάνει τις παθοφυσιολογικές μεταβολές που επάγονται κατά την επαναιμάτωση ιστών που προηγουμένως ισχαιμούσαν. Πρωταρχικό βήμα στην αλληλουχία αυτών των διεργασιών είναι η παραγωγή ελευθέρων ριζών κυρίως οξυγόνου, αλλά και αζώτου, οι οποίες αφενός είναι κυτταροτοξικές, αφετέρου ενεργοποιούν τη φλεγμονώδη απάντηση. Το σύνδρομο ισχαιμίας – επαναιμάτωσης στο ήπαρ απαντάται συχνότατα στην κλινική πράξη είτε στα πλαίσια αγγειακού αποκλεισμού του οργάνου κατά τις ηπατεκτομές είτε στα πλαίσια μεταμόσχευσης. Η βλάβη από επαναιμάτωση στο λεπτό έντερο προκαλεί διαταραχή του εντερικού φραγμού και διαπίδυση μικροοργανισμών και τοξινών από τον εντερικό αυλό στην πυλαία και στη συνέχεια στη συστηματική κυκλοφορία. Η επαγωγή τελικώς της συστηματικής φλεγμονώδους απάντησης (SIRS) συνεπάγεται την βλάβη απομακρυσμένων οργάνων (remote injury) και την εγκατάσταση του συνδρόμου πολυοργανικής ανεπάρκειας (MODS). Η απροτινίνη, ένας αναστολέας πρωτεασών, έχει χρησιμοποιηθεί σε πειραματικά πρωτόκολλα ισχαιμίας – επαναιμάτωσης με ευεργετικά αποτελέσματα. Η αντιφλεγμονώδης και αντιοξειδωτική δράση της απροτινίνης έγκειται στην ελάττωση της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, στην αποδόμηση της ελαστάσης και της καθεψίνης, στη μείωση της παραγωγής μυελοϋπεροξειδάσης και φωσφολιπάσης D από τα ουδετερόφιλα και τέλος στον περιορισμό της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν 60 άρρενες επίμυες τύπου Albino Wistar, οι οποίοι χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες των 20 ζώων. Η πρώτη ομάδα (Sham group) ήταν η ομάδα της εικονικής παρέμβασης. Στη δεύτερη ομάδα (Control group, C) εγκαταστάθηκε πνευμοπεριτόναιο σταθερής πίεσης 12mm Hg διάρκειας τεσσάρων ωρών. Στην τρίτη ομάδα (Aprotinin group, AP) έγινε ό,τι και στην ομάδα ελέγχου και επιπλέον χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά απροτινίνη σε δοσολογία ανάλογη με αυτή που χρησιμοποιείται στις καρδιοχειρουργικές επεμβάσεις. Οι ομάδες ελέγχου και απροτινίνης διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο υποομάδες των 10 ζώων, ανάλογα με το χρόνο επαναιμάτωσης (60 ή 180 λεπτά). Έτσι προέκυψαν υποομάδες με κωδική ονομασία C60, C180, AP60 και ΑΡ180. Ακολούθησε η θυσία των πειραματοζώων. Κατά τη θυσία πραγματοποιήθηκε αιμοληψία από τις καρδιακές κοιλότητες των πειραματοζώων και ελήφθησαν ιστοτεμάχια ήπατος, λεπτού εντέρου και πνεύμονα. Οι βιοχημικοί δείκτες που μετρήθηκαν ήταν: TNF-α, IL-6, ET-1, CRP, ισορροπία οξειδωτικών – αντιοξειδωτικών παραγόντων (PAB) και καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες. Στα ιστολογικά παρασκευάσματα διενεργήθηκε χρώση με αιματοξυλίνη – ηωσίνη και έγινε αποτίμηση ποικίλων χαρακτηριστικών φλεγμονής από δύο παθολογοανατόμους με τη χρήση πενταβάθμιας κλίμακας. Οι τιμές των περισσότερων βιοχημικών δεικτών στο ήπαρ ήταν χαμηλότερες στη μία ή και στις δύο υποομάδες της απροτινίνης σε στατιστικά σημαντικό βαθμό. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώθηκε από την ιστολογική εξέταση των παρασκευασμάτων με το καλύτερο σκορ να παρατηρείται στην υποομάδα AP180. Στο λεπτό έντερο δεν προέκυψε ξεκάθαρο αποτέλεσμα υπέρ των υποομάδων της απροτινίνης από τις μετρήσεις των βιοχημικών δεικτών ενώ η ιστολογική εικόνα ήταν αρκούντως πειστική ότι και στο λεπτό έντερο η απροτινίνη έδρασε προφυλακτικά. Στον πνεύμονα , οι υποομάδες ΑΡ60 και ΑΡ180 παρουσίαζαν ηπιότερη φλεγμονώδη αντίδραση, με τη δεύτερη να πλεονεκτεί στην ιστολογική εξέταση. Τέλος, στο πλάσμα δεν αναδείχθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων. Συμπερασματικά, η απροτινίνη φαίνεται να ελαττώνει σημαντικά την ιστική βλάβη που προκαλεί η σπλαχνική ισχαιμία – επαναιμάτωση από πνευμοπεριτόναιο. Το αποτέλεσμα αυτό, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα και άλλων παρόμοιων πειραματικών πρωτοκόλλων, ανοίγει το δρόμο για το σχεδιασμό κλινικών μελετών που θα διερευνήσουν την αντιφλεγμονώδη δράση της ουσίας στον άνθρωπο.