Μελέτη της μοριακής απάντησης νευρικών κυττάρων μετά από έκθεση σε υποξία

Abstract

Hypoxia is the lack of sufficient oxygenation of tissue, imposing severe stress upon cells. It is a major feature of many pathological conditions such as stroke, traumatic brain injury, cerebral haemorrhage, perinatal asphyxia and can lead to cell death due to energy depletion and increased free radical generation. The present study investigates the effect of hypoxia on the unfolded protein response of the cell (UPR), utilizing a 16 hour oxygen glucose deprivation protocol (OGD) in a PC12 cell line model. Furthermore it investigates the effect of cathepsin D inhibition using the inhibitor Pepstatin A on the expression of the proteins implicated in UPR. Expression of glucose regulated protein 78 (GRP78) and glucose regulated protein 94 (GRP94), key players of the UPR, was studied along with the expression of glucose regulated protein 75 (GRP75), heat shock cognate 70 (HSC70) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), all with respect to the cell death mechanism(s). Cells subjected to OGD displayed upregulation of GRP78 and GRP94 and concurrent downregulation of GRP75. Addition of pepstatin does not modify significantly the trends observed in the OGD samples. These findings were accompanied with minimal apoptotic cell death and induction of autophagy. Pepstatin reveals that the autophagic phenomena elicited by OGD are not completed by the 16 hour mark. The above observations warrant further investigation to elucidate whether autophagy acts as a prosurvival mechanism that upon severe and prolonged hypoxia acts as a concerted cell response leading to cell death. In our OGD model hypoxia modulates UPR and induces autophagy.

Ως υποξία ορίζεται η έλλειψη επαρκούς οξυγόνωσης του ιστού η οποία επιφέρει μεγάλο στρες στα κύτταρα. Η υποξία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε πλειάδα παθολογικών καταστάσεων όπως στο αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο, στη τραυματική εγκεφαλική κάκωση, στην εγκεφαλική αιμορραγία, στην περιγεννητική ασφυξία και μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο διαμέσου εξαντλήσεως των ενεργειακών αποθεμάτων του κυττάρου και αύξησης της παραγωγής ελευθέρων ριζών. Η παρούσα μελέτη ερευνά τα αποτελέσματα της υποξίας στην απόκριση μη σωστά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών (Unfolded Protein Response, UPR) στην κυτταρική σειρά PC12 χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο αποστέρησης οξυγόνου-γλυκόζης διάρκειας 16 ωρών. Επιπρόσθετα ερευνά το αποτέλεσμα της αναστολής των λυσοσωμικών Καθεψινών D, χρησιμοποιώντας τον αναστολέα Pepstatin A, στην έκφραση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην UPR. Η έκφραση των πρωτεϊνών GRP78 και GRP94, βασικών συντελεστών της UPR, μελετήθηκε μαζί με την έκφραση των πρωτεϊνών GRP75, HSC70 και GAPDH υπό το πρίσμα των μηχανισμών κυτταρικού θανάτου. Τα κύτταρα που εκτέθηκαν στο πρωτόκολλο παρουσίασαν αύξηση της έκφρασης της GRP78 και της GRP94 με ταυτόχρονη μείωση της έκφρασης της GRP75. Η προσθήκη Pepstatin A δεν προκάλεσε σημαντική τροποποίηση αυτών των τάσεων. Τα παραπάνω ευρήματα συνοδεύονται με ανίχνευση αυτοφαγίας στα δείγματα που εκτέθηκαν σε υποξικές συνθήκες ενώ δεν ανιχνεύτηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα απόπτωσης του κυτταρικού πληθυσμού. Η προσθήκη Pepstatin A αποκαλύπτει πως τα αυτοφαγικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα δεν έχουν ολοκληρωθεί ως τις 16 ώρες που κρατάει το πρωτόκολλο. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αξίζουν περαιτέρω διερεύνηση έτσι ώστε να διελευκανθεί αν η αυτοφαγία δρα ως κυτταροπροστατευτικός μηχανισμός ο οποίος κατά τη διάρκεια βαριάς και εκτενούς υποξίας επιφέρει τον κυτταρικό θάνατο.