Διερεύνηση της κλινικής σημασίας μοριακών δεικτών που συμμετέχουν σε κομβικά μονοπάτια της καρκινογένεσης του μη-μικροκυτταρικoύ καρκίνου του πνεύμονα

Abstract

Prognosis of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) remains dismal, with the exception of patients with early operable disease that exhibits the best rates of overall survival. In this subgroup of patients, there is urgent need for novel biomarkers with prognostic and/or predictive value. The main role of DNA repair is to correct the damages of DNA that are implicated in the process of carcinogenesis. Key molecule in this system is H2AX, and more specifically its phosphorylated type. The aim of our study was to examine the prognostic role of γ-Η2ΑΧ in patients with early operable NSCLC. We studied the immunohistochemical expression of γ-Η2ΑΧ as well as the expression levels of BRCA1 with RT-PCR, a molecule that is also implicated in the DNA repair system. We also studied the expression of p53, a classical key molecule in the regulation of apoptosis in combination with analysis of caspase 3 levels. Furthermore, we examined the genomic instability of our samples by analyzing the ploidy status with flow cytometry, Ki67 labeling index and EGFR mutations in the same cohort of 96 patients with early operable NSCLC. Our results showed that low expression levels of γ-Η2ΑΧ represent an independent factor of better overall survival in patients with early operable NSCLC. Patients with high expression levels of γ-Η2ΑΧ had a siginificantly worse overall survival (23.2 months vs 35.3 months of patients with low expression of γ-Η2ΑΧ, p=0.009). High expression levels of γ-Η2ΑΧ were significantly correlated with Τ3 tumors, advanced stage (ΙΙΙ/IV), lymphatic infiltration, aneuploidy and high expression levels of BRCA1. We also analyzed the combination of γ-Η2ΑΧ/p53 in order to define subgroups with different survival rates. The subgroup of patients with γ-Η2ΑΧ low/p53 low expression levels was associated with best survival rates as compared to the other expression profiles. Regarding BRCA1 expression analysis, our results were in keeping with the literature, showing that low BRCA1 expression levels were associated with a marginally siginificant better survival (p=0.08). An interesting finding of our results was that in the combined BRCA1/p53 analysis, BRCA1 expression was the determining factor of survival and not p53. In this context, patients with low expression of BRCA1 had a similar survival irrespective of p53 expression. We also found that BRCA1 and γ-Η2ΑΧ were significantly associated. No correlation between BRCA1 levels and EGFR mutations was detected. The use of multivariate cox proportional hazards regression analysis showed that independent factors for worse overall survival were: a) squamous carcinomas, b) N2 tumors, c) low grade tumors, d) tumors with high expression of p53 and e) tumors with high expression of γ-Η2ΑΧ. Regarding the progression free survival, patients with low expression of γ-Η2ΑΧ had an increased PFS as compared to patients with high γ-Η2ΑΧ (p=0,024). Similarly, patients with low expression of BRCA1 had also an increased PFS in comparison to patients with high expression of BRCA1 (p=0.021). Finally we analyzed our data with artificial neural networks (ANNs). ANNs outweighed logistic regression analysis in terms of accuracy. ANNs had a prediction success rate of about 88%. Although the success rate of correct prediction was not 100%, this study shows that the rate can be improved step by step when parameters and novel molecular parameters involved in lung cancer are added and considered together.

Η πρόγνωση των ασθενών με ΜΜΚΠ παραμένει δυσμενής με την υποομάδα των ασθενών με χειρουργήσιμο ΜΜΚΠ να εμφανίζει τα καλύτερα ποσοστά επιβίωσης. Σ’αυτήν την υπoομάδα ασθενών προβάλλει η ανάγκη εύρεσης νέων βιοδεικτών που να έχουν προγνωστικό ή/και προβλεπτικό ρόλο. Το DNA repair system είναι ένα σύστημα που στόχο έχει να επιδιορθώνει τις βλάβες στο γενετικό υλικό που εμπλέκονται στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Μόριο κλειδί σ’αυτό το σύστημα είναι η ιστόνη Η2ΑΧ της οποίας η φωσφορυλιωμένη μορφή κατέχει κεντρικό ρόλο στη διαδικασία επιδιόρθωσης του DNA. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσουμε τον προγνωστικό ρόλο της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της γ-Η2ΑΧ σε ασθενείς με πρώιμο ΜΜΚΠ. Παράλληλα μελετήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης BRCA1 που εμπλέκεται και αυτή στο σύστημα επιδιόρθωσης του DNA με την τεχνική της real time PCR. Για την πληρέστερη κατανόηση του μηχανισμού επιδιόρθωσης/απόπτωσης αποφασίσαμε να μελετήσουμε παράλληλα και την έκφραση της p53 που αποτελεί κλασικό μόριο της αποπτωτικής διαδικασίας από κοινού με την κασπάση 3. Επιπλέον μελετήθηκαν το επίπεδο ανευπλοειδίας των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, ο δείκτης πολλαπλασιασμού των κυττάρων Ki67 και η παρουσία μεταλλάξεων του EGFR σε μια πλήρη βάση δεδομένων από 96 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων μας φάνηκε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία ότι η χαμηλή έκφραση της γ-Η2ΑΧ αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα καλύτερης επιβίωσης σε ασθενείς με ΜΜΚΠ. Έτσι οι ασθενείς που είχαν υψηλά επίπεδα γ-Η2ΑΧ εμφάνισαν στατιστικά σημαντική χειρότερη επιβίωση (23.2 μήνες έναντι 35.3 μηνών των ασθενών με χαμηλή έκφραση της γ-Η2ΑΧ, p=0.009). Επιπλέον, φάνηκε ότι τα υψηλά επίπεδα της γ-Η2ΑΧ συσχετίζονται στατιστικά σημαντικά με μεγαλύτερους (Τ3) όγκους ,προχωρημένο στάδιο νόσου (ΙΙΙ/IV), παρουσία λεμφαγγειακής διήθησης ,ανευπλοειδία και υψηλή έκφραση BRCA1. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η συνέκφραση της γ-Η2ΑΧ και της p53 οριοθετεί ξεχωριστές υποομάδες ασθενών που διαφέρουν στην πρόγνωση, με την υποομάδα με γ-Η2ΑΧ χαμηλή έκφραση/p53 χαμηλή έκφραση να εμφανίζει τα καλύτερα ποσοστά επιβίωσης. Η ανάλυση της έκφρασης του BRCA1 επιβεβαίωσε το ήδη γνωστό από τη βιβλιογραφία, οτι δηλαδή ασθενείς με χαμηλή έκφραση του BRCA1 είχαν οριακά στατιστικά σημαντική καλύτερη επιβίωση (p=0.08). Ενδιαφέρον εύρημα της μελέτης μας ήταν το γεγονός ότι κατά την εξέταση της συνέκφρασης BRCA1/p53 αυτό που καθόριζε την επιβίωση ήταν η έκφραση του BRCA1 παρά το p53. Ασθενείς δηλαδή με χαμηλή έκφραση BRCA1 είχαν παρόμοια επιβίωση ανεξαρτήτως έκφρασης του p53. Επιπλέον για πρώτη φορά συσχετίστηκε το ΒRCA1 με την ιστόνη γ-Η2ΑΧ και βρέθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ τους. Η έκφραση του BRCA1 στη μελέτη μας δεν βρέθηκε να σχετίζεται με την παρουσία ή όχι μεταλλάξεων του EGFR. Η χρήση πολυπαραγοντικής ανάλυσης αποκάλυψε ότι επιπλέον ανεξάρτητοι παράγοντες μικρότερης συνολικής επιβίωσης ήταν α) τα πλακώδη καρκινώματα, β) οι χαμηλής διαφοροποίησης (low grade) όγκοι, γ) όγκοι με υψηλή έκφραση p53 και δ) υψηλή έκφραση γ-Η2ΑΧ. Ο διάμεσος χρόνος ελεύθερος υποτροπής ήταν μεγαλύτερος στους ασθενείς με χαμηλή έκφραση της γ-Η2ΑΧ σε σχέση με αυτούς που είχαν υψηλή έκφραση της γ- Η2ΑΧ , και η διαφορά αυτή ήταν στατιστικά σημαντική (p=0,024). Παρόμοια, οι ασθενείς με χαμηλή έκφραση BRCA1 είχαν μεγαλύτερη διάμεση διάρκεια χωρίς υποτροπή έναντι των ασθενών με υψηλή έκφραση BRCA1, και η διαφορά αυτή ήταν επίσης στατιστικά σημαντική (p=0.021). Τέλος, αναλύσαμε τα δεδομένα μας και με τη βοήθεια τεχνητών νευρωνικών δικτύων. Συγκεκριμένα, τα τεχνητά νευρωνικά δίκτυα υπερίσχυσαν σημαντικά της ανάλυσης λογιστικής παλινδρόμησης σε όρους ακρίβειας. Τα τεχνητά νευρωνικά δίκτυα ΑΝΝ είχαν ένα λόγο επιτυχούς πρόβλεψης της έκβασης περίπου ίσο με 88%. Παρόλο που ο λόγος ορθής πρόβλεψης δεν ήταν 100%, η ανάλυση μας έδειξε ότι το ποσοστό αυτό μπορεί να βελτιωθεί σταδιακά με την προσθήκη νέων μοριακών παραμέτρων που εμπλέκονται στον καρκίνο του πνεύμονα.