Ο ρόλος των ιών corona NL63 και HKU1, parainfluenza 4, polyomavirus WU και KI και των εντεροϊών σε παιδιά με λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος

Abstract

Respiratory infections are responsible for a significant portion of morbidity and mortality among humans.The main goal of this thesis was to develop in-house molecular methods in order to investigate the participation of human coronaviruses NL63 and HKU1, human parainfluenza virus type 4, human polyomaviruses WU and KI and human enteroviruses in upper and lower respiratory tract infections affecting children.The study of the epidemiology and clinical data tried to link the presence of these viruses with the respiratory infection.Finally the analysis part of the genome sequences of coronaviruses NL63 and enteroviruses revealed the genetic diversity of these viruses.Nasal swabs and washes collected from patients aged 0-18 years old during winter periods 2005-2006,2006-2007 and 2007-2008.The patients presented with influenza like illness .Molecular methods with specific promers and probes for the above mentioned viruses were chosen from bibliography and optimized.Multiplex Real Time PCR for the detection of human polyomavirus WU and KI,RT-PCR for the detection of human parainfluenza virus type 4,multiplex RT Real Time PCR for the detection of human coronaviruses NL63 and HKU1 and RT-Real Time PCR for human enteroviruses.750 specimens were analysed.136 (18,1%) were found positive for one of the above mentioned viruses.Specifically,32 specimens were found positive for polyomaviruses,33 for human enteroviruses,16 for human parainfluenza virus type 4 and 55 positive for coronaviruses.Representative samples positive for human coronavirus NL63 and human enteroviruses were chosen and sequenced.9 NL63 specimens were sequenced ,2 of them circulated in2006,5 in 2007 and 2 in 2008.Comparison of aminoacid and nucleotide showed that the strains circulatin in 2006 and 2007 were identical whereas the strains circulation in 2008 presented with 89,9% nucleotide homology and 79% aminoacid homology.9 strains of human enteroviruses were sequenced revealing the circulation of different types of human enteroviruses.

Οι λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος είναι από τις πιο συνηθισμένες ασθένειες παγκοσμίως, προκαλώντας σημαντικό ποσοστό νοσηρότητας και θνησιμότητας στους ανθρώπους. Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως σκοπό την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μοριακών μεθόδων για τη διερεύνηση της συμμετοχής των αναπνευστικών ιών κορόνα NL63 και HKU1, της παραγρίπης , των πολύομα WU και KI και των εντεροϊών σε λοιμώξεις του ανώτερου και κατώτερου αναπνευστικού συστήματος. Ακολούθησε η μελέτη της επιδημιολογίας και η συλλογή κλινικών δεδομένων με σκοπό την πιθανή συσχέτισή τους με την εμφάνιση του κάθε ιού, καθώς και η ανάλυση της αλληλουχίας αντιπροσωπευτικών στελεχών του κορόνα NL63 και των εντεροϊών.Το υλικό που χρησιμοποιήθηκε, συλλέχθηκε κατά τη χειμερινή περίοδο τριών συνεχόμενων ετών, 2005-06, 2006-07 και 2007-08, και περιελάμβανε ρινικά επιχρίσματα και εκπλύματα από ασθενείς ηλικίας 0-18 ετών που εμφάνιζαν συμπτώματα λοίμωξης του αναπνευστικού συστήματος. ια την ανίχνευση των παραπάνω ιών χρησιμοποιήθηκαν μοριακές μέθοδοι, με τη χρήση εκκινητών που ήταν ειδικοί για συντηρημένες περιοχές του γονιδιώματός τους, οι οποίες περιελάμβαναν μία απλή ανάστροφής μεταγραφής PCR για την παραγρίπη , μία διπλή PCR πραγματικού χρόνου για τους πολυόμα WU και KI, μία διπλή ανάστροφής μεταγραφής PCR πραγματικού χρόνου για τους κορόνα NL63 και HKU1 και μια ανάστροφης μεταγραφής PCR πραγματικού χρόνου για τους εντεροϊούς. Για την ανάλυση της αλληλουχίας των NL63 στελεχών και των στελεχών των εντεροϊών χρησιμοποιήθηκαν μη-συντηρημένες περιοχές και η συσχέτισή τους έγινε μέσω απεικόνισης σε φυλογενετικά δέντρα.Συνολικά, 750 δείγματα συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, από τα οποία 136 (18,1%) βρέθηκαν θετικά για κάποιον από τους υπό μελέτη αναπνευστικούς ιούς. Συγκεκριμένα, 32 ασθενείς βρέθηκαν θετικοί σε πολυόμα, 33 σε εντεροϊούς, 16 σε παραγρίπη και 55 σε hCoV.Αντιπροσωπευτικά δείγματα που βρέθηκαν θετικά για τους ιούς hCoV NL63 και τους εντεροϊούς κατά τις τρεις χειμερινές περιόδους επιλέχθηκαν για να μελετηθούν φυλογενετικά. Από τα 41 θετικά για τον NL63 δείγματα επιλέχθηκαν 9 από αυτά ώστε να μελετηθούν φυλογενετικά. Από τα στελέχη αυτά, 2 απομονώθηκαν το 2006, 5 απο-μονώθηκαν το 2007 και τα υπόλοιπα 2 το 2008. Η σύγκριση της αλληλουχίας έδειξε ότι σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και αμινοξέων τα στελέχη του 2006 και του 2007 ήταν όμοια, ενώ τα στελέχη που κυκλοφόρησαν το 2008, παρουσίαζαν νουκλεοτιδική ομολογία 89,9% και αμινοξική ομολογία 79%. Επίσης μελετηθηκαν 9 στελέχη εντεροϊών και αποκαλύφθηκε η κυκλοφορία διαφορετικών και ποικίλων στελεχών.