Ο ρόλος της MAP3 κινάσης Tpl2/Cot σε κυτταρικές αποκρίσεις που αφορούν σε φλεγμονές και βλάβη του DNA

Abstract

Tpl2/Cot is a MAP3 kinase (MAP3K8) with a diverse role in signalingpathways governing immune and inflammatory responses as well ascarcinogenesis. The present thesis explores the physical and functionalinteraction between TPL2 and Nucleophosmin (NPM, B23). TPL2 is shown forthe first time to reside partially in the nucleoli of rested cells where it interactswith NPM and mediates its basal phosphorylation levels at Thr199. Undergenotoxic or ribosomal stress TPL2 guides the partial K48-linkedubiquitination of phosphorylated NPM at lysine Lys229. Subsequently, theunaffected and probably homodimerized non-phosphorylated NPMtranslocates from the nucleoli to the nucleoplasm where it binds HDM2, thephysiological inhibitor of p53. Released p53 unfolds its acting repertoireleading to apoptosis of stressed cells. In a feedback regulatory loop, stressinducedupregulated NPM blocks aberrant TPL2 production transcriptionally inorder to preserve fine-tuning of the cell response to DNA damage stress.In another context of experiments, TPL2 was found to mediate the productionof the pro-inflammatory and cancer-related cytokine IL-6 downstream ofTpl2/Cot is a MAP3 kinase (MAP3K8) with a diverse role in signalingpathways governing immune and inflammatory responses as well ascarcinogenesis. The present thesis explores the physical and functionalinteraction between TPL2 and Nucleophosmin (NPM, B23). TPL2 is shown forthe first time to reside partially in the nucleoli of rested cells where it interactswith NPM and mediates its basal phosphorylation levels at Thr199. Undergenotoxic or ribosomal stress TPL2 guides the partial K48-linkedubiquitination of phosphorylated NPM at lysine Lys229. Subsequently, theunaffected and probably homodimerized non-phosphorylated NPMtranslocates from the nucleoli to the nucleoplasm where it binds HDM2, thephysiological inhibitor of p53. Released p53 unfolds its acting repertoireleading to apoptosis of stressed cells. In a feedback regulatory loop, stressinducedupregulated NPM blocks aberrant TPL2 production transcriptionally inorder to preserve fine-tuning of the cell response to DNA damage stress.In another context of experiments, TPL2 was found to mediate the productionof the pro-inflammatory and cancer-related cytokine IL-6 downstream of TNFRI signaling. TPL2 associates with the NF-κB transcription factor familymember IKKα in TNF-stimulated cells and regulates IKKα nuclear localizationand IKKα-mediated IL-6 transcriptional activation. Furthermore, a microRNAmicroarray analysis in samples from primary BMDMs of wild type or TPL2knock out mice treated with TNF revealed a unique molecular signature of deregulatedmicroRNA expression associated with aberrant expression of theirmRNA targets. Specifically, microRNAs mmu-miR 223, mmu-let-7a and mmulet-7i were found to target IL-6 3’-UTR in silico and are postulated to regulatepost-transcriptionally IL-6 production following cell stimulation with TNF.

Η πρωτεΐνη TPL2/Cot είναι μία MAP3 κινάση (MAP3K8) που συντονίζει τηνκυτταρική σηματοδότηση μονοπατιών σχετιζόμενων με ανοσολογικέςαποκρίσεις, φλεγμονή και καρκινογένεση. Το κύριο μέρος της παρούσαςδιατριβής αφορά τη μελέτη της αλληλεπίδρασης της TPL2 με τηφωσφοπρωτεΐνη Nucleophosmin (NPM, B23). Αρχικά, αποδεικνύεταιπειραματικά η μερική παρουσία της TPL2 στον πυρήνα αντίθετα με τη γενικήπεποίθηση που υποστηρίζει την αμιγή κυτταροπλασματική της θέση. Έπειτα,παρατίθενται δεδομένα που αποδεικνύουν τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης καιυποκυτταρικού συνεντοπισμού της TPL2 με την NPM, τόσο σε τεχνητές (invitro) όσο και σε φυσιολογικές συνθήκες (in vivo). Συγκεκριμένα, η TPL2εντοπίζεται μερικώς στον πυρηνίσκο όπου και συνδέεται με την NPM καιελέγχει τα βασικά επίπεδα φωσφορυλίωσης της στη θρεονίνη Thr199, γεγονόςπου εντάσσει τις MAP3K πρωτεΐνες στην πληθώρα κινασών που επηρεάζουντη φυσιολογία της NPM μέσω φωσφορυλίωσης.Υπό την επήρεια γενοτοξικού ή ριβοσωμικού στρες, η TPL2 κατευθύνει τηνK48-σχετιζόμενη ουβικουϊτίνωση της φωσφορυλιωμένης NPM στη λυσίνηLys229 και την επακόλουθη αποικοδόμηση της στο πρωτεάσωμααποδεικνύοντας τη δυναμική αλληλεξάρτηση των μετα-μετφραστικώντροποποιήσεων στην κυτταρική σηματοδότηση. Στη συνέχεια, η μηφωσφορυλιωμένη και πιθανά ομοδιμερής NPM εξέρχεται από τον πυρηνίσκοστο πυρηνόπλασμα και προσδένεται στη HDM2 αποδεσμεύοντας την από τηνp53, την οποία η HDM2 καταστέλλει κάτω από φυσιολογικές συνθήκεςοδηγώντας την στο πρωτεάσωμα για αποικοδόμηση. Η ελεύθερη p53 μπορείεν συνεχεία να ενεργοποιήσει το μεταγραφικό της πρόγραμμα με τελικόσκοπό την κυτταρική απόπτωση ανάλογα με το υφιστάμενο στρες. Μέσω ενόςμηχανισμού ανάδρασης, η NPM, τα επίπεδα της οποίας αυξάνονται κάτω απόκυτταρικό στρες, σταματά τη μεταγραφή της νεοσυντιθέμενης TPL2αποτρέποντας πιθανά την υπέρμετρη ενεργοποίηση των σχετιζόμενων με τοεν λόγω στρες σηματοδοτικών μονοπατιών.Παράλληλα, παρουσιάζονται δεδομένα που υποστηρίζουν τη δράση της TPL2στην παραγωγή της προ-φλεγμονώδους και καρκινογενούς κυτοκίνης IL-6μέσω δύο οδών. Πιο αναλυτικά, η TPL2 αποδεικνύεται απαραίτητη για τημεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-6, από τον παράγοντα IKKαέπειτα από ερεθισμό των κυττάρων με τον αποπτοτική κυτοκίνη TNF. Ηάμεση αλληλεπίδραση της TPL2 με την IKKα καθορίζει πιθανά μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων την επαγόμενη από TNF υποκυτταρικήμετατόπιση της IKKα στον πυρήνα και την επακόλουθη πρόσδεσή της στονυποκινητή του γονιδίου της IL-6.Ταυτόχρονα, η TPL2 βρέθηκε να ρυθμίζει τα επίπεδα του mRNA της IL-6μέσω της ενεργοποίησης μιας σειράς μικρών RNA μορίων (miRNAs) πουστοχεύουν το άκρο 3’-UTR του εν λόγω mRNA. Ανάλυση έκφρασης μορίωνmicroRNA ευρείας κλίμακας (microarrays) σε πρωτογενή μακροφάγα κύτταραποντικών που φέρουν ή όχι το γονίδιο της TPL2 και έχουν ερεθιστεί με TNFέδειξε ότι η TPL2 επηρεάζει την έκφραση διαφόρων micrοRNAs, ενώειδικότερα τα microRNAs mmu-miR 223, mmu-let-7a και mmu-let-7i, που έχουν στόχο το 3’-UTR της IL-6, ελέγχονται από την TPL2 και πιθανάρυθμίζουν τα επίπεδα της IL-6 σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο.Η παρούσα διατριβή υποστηρίζει το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει ηκινάση TPL2 στη ρύθμιση του μικροπεριβάλλοντος μιας καρκινικής οντότηταςκαι προσφέρει επιστημονικά δεδομένα για μελλοντική καταπολέμησηκαρκινικών τύπων μέσω φαρμακολογικής αναστολής της TPL2.